Selektiv Märkning av proteiner på cellernas ytor med hjälp av CyDye Dige Fluor Minimal Färgämnen

Summary

En enkel och specifik metod visades för lysrör märkning och förbättrad detektering av proteiner cellens yta utan en fraktionering steg. Differential överflöd i proteiner på cellens yta analyserades med hjälp av tvådimensionella (2-D) elektrofores och Ettan ™ Dige teknik.

Abstract

Ytproteiner är centrala för cellens förmåga att reagera på sin omgivning och att samverka med angränsande celler. De är kända för att vara inducerare av nästan alla intracellulär signalering. Dessutom spelar de en viktig roll i miljöanpassning och missbruksbehandling, och deltar ofta i sjukdomens patogenes och patologi (1). Protein-protein interaktioner är inneboende signalvägar, och för att få mer insikt i dessa komplexa biologiska processer, är känsliga och tillförlitliga metoder som behövs för att studera proteiner på cellens yta. Tvådimensionella (2-D) elektrofores används i stor utsträckning för detektion av biomarkörer och andra mål i komplexa protein prover för att studera differentiella förändringar. Cellytan proteiner, delvis på grund av deras låga förekomst (1 2% av cellulära proteiner), är svåra att upptäcka i en 2-D gel utan fraktionering eller någon annan typ av berikning. De är också ofta dåligt representerade i 2-D-geler på grund av sin hydrofoba natur och höga molekylvikten (2). I denna studie presenterar vi ett nytt protokoll för intakta celler med CyDye Dige Fluor minimal färgämnen för särskild märkning och upptäckt av denna viktiga grupp av proteiner. Resultaten visade särskild märkning av ett stort antal proteiner på cellens yta med minimal märkning av intracellulära proteiner. Detta protokoll är snabb, enkel att använda, och alla tre CyDye Dige Fluor minimal färgämnen (Cy 2, Cy 3 och Cy 5) kan användas för att märka proteiner på cellernas ytor. Dessa funktioner möjliggör multiplexing med 2-D Fluorescens Elektrofores Skillnad Gel (2-D Dige) med Ettan Dige teknik och analys av förändringar proteinuttryck med DeCyder 2-D Differential analysprogram. Graden av proteiner på cellernas ytor följdes under serum svält i CHO celler för olika lång tid (se tabell 1). Små förändringar i överflöd upptäcktes med hög noggrannhet, och resultaten stöds av definierade statistiska metoder.

Protocol

Cellodling Väx kinesiska hamsteräggceller (CHO-K1) med hjälp av standardprocedurer cellodling i F-12 Skinka medium med GlutaMAX jag innehållande 10% fetalt kalvserum, 50 U / ml penicillin, och 50 mikrogram / ml streptomycin sulfat (Invitrogen). Börsen odlingsmediet till serum-fria medier. Märk cellytan proteiner var vid olika tidpunkter med CyDye Dige Fluor Cy3 eller Cy5 minimala färgämnen (se avsnitt märkning cellytan, nedan). Pool lika många celler från varje tidpunkt…

Discussion

Proteinkoncentration

En översikt av de två märkning arbetsflöden visas i figur 1. Eftersom cellerna är fortfarande intakt när märkas enligt cellytan protein märkning protokoll, bara cellytan proteiner som utsätts för färgen. I standard Ettan Dige protokollet, de celler lyseras före märkning och proteiner såväl inom som utanför cellen är märkta (Fig. 1). Den relativa mängden färgämne till protein i cellen-ytprotein märkning-protokollet är inte känt, eftersom proteiner p?…

Materials

Material Name	Type	Company	Catalogue Number	Comment
CyDye DIGE Kit, 2 nmol	Reagent	GE Healthcare	28-9345-30
2-D Quant Kit	Reagent	GE Healthcare	80-6484-51
IPG Buffer pH 3-11NL	Reagent	GE Heallthcare	17-6004-40
Immobiline DryStrip pH 3-11NL, 24 cm	Reagent	GE Healthcare	17-6003-77
IPGbox	Tool	GE Healthcare	28-9334-65
IPGbox kit	Tool	GE Healthcare	28-9334-92
DeStreak Rehydration solution	Reagent	GE Healthcare	17-6003-19
Immobiline DryStrip Cover Fluid	Reagent	GE Healthcare	17-1335-01
Ettan IPGphor 3 IEF Unit	Instrument	GE Healthcare	11-0033-64
Ettan IPGphor Manifold	Instrument component	GE Healthcare	80-6498-38
Ettan DALTtwelve Gel Caster	Tool	GE Healthcare	80-6467-22
Ettan DALTtwelve Separation Unit and Power Supply/Control Unit	Instrument	GE Healthcare	80-6466-46	230 V unit: 80-6466-27
Typhoon 9410 Variable Mode Imager	Instrument	GE Healthcare	63-0055-81
Ettan Spot Picker	Instrument	GE Healthcare	18-1145-28
Ettan Digester	Instrument	GE Healthcare	18-1142-68
Ettan Spotter	Instrument	GE Healthcare	18-1142-67
Ettan MALDI-TOF	Instrument	GE Healthcare	18-1142-33
DeCyder 2-D Differential Analysis Software	Other	GE Healthcare	28-4012-01
ImageQuant Analysis Software	Other	GE Healthcare	28-9236-62
Urea	Reagent	GE Healthcare	17-1319-01
CHAPS	Reagent	GE Healthcare	17-1314-01
PlusOne Dithiothreitol (DTT)	Reagent	GE Healthcare	17-1318-01
Bromophenol Blue	Reagent	GE Healthcare	17-1329-01
Tris	Reagent	GE Healthcare	17-1321-01
Sodium Dodecylsulfate (SDS)	Reagent	GE Healthcare	17-1313-01
PlusOne Glycerol 87%	Reagent	GE Healthcare	17-1325-01
PlusOne ReadySol IEF 40% T, 3% C	Reagent	GE Healthcare	17-1310-01
PlusOne TEMED	Reagent	GE Healthcare	17-1312-01
PlusOne Ammonium Persulfate	Reagent	GE Healthcare	17-1311-01
PlusOne Glycine	Reagent	GE Healthcare	17-1323-01
2-D Sample Prep for membrane proteins	Reagent	Pierce	89864
Streptomycin sulphate	Reagent	Invitrogen	15140-122