Selektiv Märkning av proteiner på cellernas ytor med hjälp av CyDye Dige Fluor Minimal Färgämnen

Summary

En enkel och specifik metod visades för lysrör märkning och förbättrad detektering av proteiner cellens yta utan en fraktionering steg. Differential överflöd i proteiner på cellens yta analyserades med hjälp av tvådimensionella (2-D) elektrofores och Ettan ™ Dige teknik.

Abstract

Ytproteiner är centrala för cellens förmåga att reagera på sin omgivning och att samverka med angränsande celler. De är kända för att vara inducerare av nästan alla intracellulär signalering. Dessutom spelar de en viktig roll i miljöanpassning och missbruksbehandling, och deltar ofta i sjukdomens patogenes och patologi (1). Protein-protein interaktioner är inneboende signalvägar, och för att få mer insikt i dessa komplexa biologiska processer, är känsliga och tillförlitliga metoder som behövs för att studera proteiner på cellens yta. Tvådimensionella (2-D) elektrofores används i stor utsträckning för detektion av biomarkörer och andra mål i komplexa protein prover för att studera differentiella förändringar. Cellytan proteiner, delvis på grund av deras låga förekomst (1 2% av cellulära proteiner), är svåra att upptäcka i en 2-D gel utan fraktionering eller någon annan typ av berikning. De är också ofta dåligt representerade i 2-D-geler på grund av sin hydrofoba natur och höga molekylvikten (2). I denna studie presenterar vi ett nytt protokoll för intakta celler med CyDye Dige Fluor minimal färgämnen för särskild märkning och upptäckt av denna viktiga grupp av proteiner. Resultaten visade särskild märkning av ett stort antal proteiner på cellens yta med minimal märkning av intracellulära proteiner. Detta protokoll är snabb, enkel att använda, och alla tre CyDye Dige Fluor minimal färgämnen (Cy 2, Cy 3 och Cy 5) kan användas för att märka proteiner på cellernas ytor. Dessa funktioner möjliggör multiplexing med 2-D Fluorescens Elektrofores Skillnad Gel (2-D Dige) med Ettan Dige teknik och analys av förändringar proteinuttryck med DeCyder 2-D Differential analysprogram. Graden av proteiner på cellernas ytor följdes under serum svält i CHO celler för olika lång tid (se tabell 1). Små förändringar i överflöd upptäcktes med hög noggrannhet, och resultaten stöds av definierade statistiska metoder.

Protocol

Cellodling

1. Väx kinesiska hamsteräggceller (CHO-K1) med hjälp av standardprocedurer cellodling i F-12 Skinka medium med GlutaMAX jag innehållande 10% fetalt kalvserum, 50 U / ml penicillin, och 50 mikrogram / ml streptomycin sulfat (Invitrogen).
2. Börsen odlingsmediet till serum-fria medier. Märk cellytan proteiner var vid olika tidpunkter med CyDye Dige Fluor Cy3 eller Cy5 minimala färgämnen (se avsnitt märkning cellytan, nedan).
3. Pool lika många celler från varje tidpunkt och etikett med CyDye Dige Fluor Cy2. Använd dessa som en inre standard för varje 2-D gel.
4. Majoriteten av de experiment kan utföras med CHO-K1-celler, men musen embryot fibroblaster (3T3 L1) och ascites muslymfomceller lymfoblaster (EL4) kan också användas (data visas inte).
5. Väx de två senare celltyper i DMEM medium med GlutaMAX II, men annars använder identiska villkor används för CHO-K1-celler.

Cellytan märkning

1. Lossa försiktigt vidhäftande cellerna icke-enzymatiskt, räkna och dela in i portioner på 5-10 x106 celler. För celler som växer i suspension, utelämna loss steget.
2. Centrifugera cellsuspensioner ca 800 xgi 5 minuter. Ta bort supernatanterna innehåller mediet.
3. Tvätta pellets genom resuspendion i 1 ml iskallt Hanks Balanced Salt Solution (HBSS) pH 8,5. Centrifugeras vid 800 xg vid 4 ° C i 2 minuter.
4. Avlägsna supernatanten och resuspendera cellpelleten i 200 l iskallt märkning buffert (HBSS pH 8,5, 1 M urea).
5. Märk intakta celler med 600 pmol CyDye Dige Fluor minimal färgämnen för 20 minuter på isen i mörkret.
6. Släck reaktionen genom att tillsätta 20 l 10 mM lysin. Inkubera i 10 minuter.
7. Tvätta ytan-märkta celler två gånger av återsuspension i 500 l HBSS pH 7,4, följt av centrifugering vid 800 xg vid 4 ° C i 2 minuter.

Cellslys och fraktionering

1. Lyse ytan-märkta celler i 150 l kallt lyseringsbuffert (7 M urea, 2 M tiourea, 4% käkar, 30 mM Tris, 5 mm magnesium-acetat pH 8,5). Lämna på is i minst 1 timme med enstaka vortexa.
2. Centrifugera lysates vid 10 000 xg vid 4 ° C i 5 minuter. Överför supernatanten till ett nytt rör. Detta prov är den icke-fraktionerade prov som innehåller alla cellulära proteiner.
3. Parallellt tvätta cell pellets, som ovan, sedan fraktioneras (med hjälp av ett kit membran fraktionering, Pierce) i membranet och cytosola fraktioner före 2-D gelelektrofores. Membranet fraktionen innehåller inre och cellens proteiner yta membran.
4. Som jämförelse följer standarden Ettan Dige förfarande ^3, och Lyse, etikett, och slutligen fraktioneras cellerna. Fastställa proteinets koncentration i proverna med 2 - D Quant Kit (GE Healthcare).

2-D elektrofores

1. Rehydrera Immobiline DryStrip geler, pH 3-11NL (24 cm) med Immobiline DryStrip Reswelling fack, 24 cm i 450 l DeStreak vätskeersättning (0,5% IPG Buffer) över natten.
2. Applicera CyDye-märkta prover (motsvarande 50 mikrogram totalprotein) till Immobiline DryStrip geler med anodiska kopp lastning i grenröret och utföra isoelektrisk fokusering (IEF) med Ettan IPGphor II IEF systemet enligt anvisningarna.
3. Efter IEF, balansera remsorna i två steg och placera på toppen av stora (26 x 20 cm) 12,5% polyakrylamidgeler (SDS-PAGE). Overlay med 0,5% agaros (i körklart buffert innehållande Bromfenolblått). Kör 2-D elektrofores med hjälp av Ettan DALTtwelve stora vertikala systemet på 5 W / gel i 30 min och sedan på 15 W / gel tills färgen når botten av gelen.

Imaging och dataanalys

1. Efter avslutad 2-D elektrofores, skanna geler för Cy2, Cy3 eller Cy5 med en Typhoon 9410 Variable läge Imager.
2. Jämför plats kartor från membranet fraktioner, cytosoliskt fraktioner, och icke-fraktionerade prover med DeCyder 2-D Differential Analysis Software ^4.

Post-färgning

1. Efter bildbehandling, silver färga geler enligt standard förfarande ^5.

Protein identifiering

1. Odla, skörda, tvätta och Lyse preparativ belopp (cirka 1 mg sammanlagda proteinhalten från 10 x106 CHO-celler) av celler, som beskrivs ovan för en icke-fraktionerade prov. Använd en Cy5 cellytan märkt prov (se ovan) som en spik, och tillämpa tillsammans med de omärkta förberedande mängder protein.
2. Utför 2-D elektrofores som beskrivs ovan, men den här gången, betydelser som här anges 600 mikrogram omärkta cell lysat tillsammans med 50 mikrogram cellytan märkt spik genom anodiska kopp ansökan. Använd referens markörer för att ge rätt plats att plocka, och plats varalan glasplattorna innan gelen gjutning enligt rekommendationer ^3.
3. Scan gelen i Cy5 kanal för att få Cy5 cellen kartan ytan plats, följt av totalprotein färgning med Deep Purple totalprotein fläcken ^3.
4. Matcha ihop de två plats kartorna med DeCyder 2-D mjukvara och skapar en plocklista för alla de ställen som motsvarar Cy 5 märkta proteiner cellytan. Plocka proteiner cellens yta med hjälp av Ettan stationen plats hantering, utdrag ur gelen pluggar och trypsinate med Ettan rötkammare. Identifiera med hjälp av MALDI-TOF masspektrometri.

Tabell 1. En Ettan Dige experiment utfördes med hjälp av prover från serum utarmat celler märkas enligt cellytan proteiner märkning protokollet i figur 1.

Exempel på	Tid av serum utarmning	Märkta med CyDye	Gel nummer
1	-	Cy 3, Cy 2	1
2	30 minuter	Cy 5, Cy 2	1
3	2 timmar	Cy 3, Cy 2	2
4	4 timmar	Cy 5, Cy 2	2
5	16 timmar	Cy 5, Cy 2	3

Discussion

Proteinkoncentration

En översikt av de två märkning arbetsflöden visas i figur 1. Eftersom cellerna är fortfarande intakt när märkas enligt cellytan protein märkning protokoll, bara cellytan proteiner som utsätts för färgen. I standard Ettan Dige protokollet, de celler lyseras före märkning och proteiner såväl inom som utanför cellen är märkta (Fig. 1). Den relativa mängden färgämne till protein i cellen-ytprotein märkning-protokollet är inte känt, eftersom proteiner på cellernas ytor inte specifikt kan kvantifieras. Det är dock känt att cellytan proteiner utgör en mycket liten andel av de cellulära proteiner ^2. Cirka 5-10 x10 ⁶ celler till 600 pmol färgämne användes. Det kan vara möjligt att använda färre celler eftersom endast 12,5 till 25% av nonfractionated provet i denna studie användes för 2-D elektrofores.

Fig. 1. Översikt över märkning arbetsflöde protokoll

Protein koncentrationer i de olika fraktionerna bestämdes med hjälp av 2-D Quant Kit. Det totala protein beloppet från 10 x10 ⁶ CHO-K1-celler 920 mikrogram i den icke-fraktionerade prov, 225 mikrogram i membranet / hydrofoba fraktionen och 770 mikrogram i cytosoliskt / hydrofila fraktionen. Dessa belopp kommer sannolikt att variera beroende på celltyp och cellstorlek. Andelen av proteiner som är märkta på cellytan protokoll kan vara högre än standard Ettan Dige minimal märkning, vilket är 2-3% av totalt protein. Det verkar som om bara ett färgämne molekyl är fäst per proteinmolekyl, är sedan platsen formen är rund och vertikala strimmor av lågmolekylära proteiner på geler frånvarande (Fig. 2 och 3). Två och mer färg molekyler per proteinet skulle orsaka vertikala streck på grund av ökad molekylvikt av den märkta proteinet. Detta fenomen skulle kunna ses med lågmolekylära proteiner, eftersom en förändring i molekylvikt av dessa proteiner skulle resultera i en större förändring på gelen jämfört med hög molekylvikt proteiner.

Cellytan protein särskild märkning

Två identiska prover av celler ytan märkt med CyDye Dige Fluor Cy3. En var lyseras och används direkt för 2-D elektrofores. Det andra provet var lyseras och fraktionerad in i membranet och cytosola fraktioner. Hela fluorescerande etikett dök upp i membranet fraktionen, den cytosoliskt bråkdel saknade märkta proteiner (Fig. 2). Samma gel med cytosolproteinet urvalet var silver målat och resultatet visade att det fanns proteiner i gelen, men de var inte märkta med cellytan protokoll protein märkning. Dessa resultat tyder på att den nya märkningen protokollet är specifikt för proteiner på cellens yta. Den CyDye Dige Fluor minimal färgämnet verkar inte komma in i cellen eller passera genom cellmembranet. Cellerna förvaras på is före märkning och detta kan minska eventuella transport över membranet. Tiden för CyDye Dige Fluor minimal färgämne exponeringen är också relativt kort (20 minuter), vilket är tillräckligt för protein märkning men inte för inträde i cellen. En annan möjlig förklaring till bristen på märkningen inne i cellen är att även om färgen passerar över membranet, är pH inuti cellen för låg (<pH 7,4) för en effektiv märkning reaktion förekomma (optimalt pH 8,5). Märkningen reaktionen är släckt följt av tvättning av celler, vilket ytterligare förhindrar protein etiketten efter cellerna har lyseras. Denna metod har med framgång tillämpas på mänskliga cellinjer in vitro samt ett komplext biologiskt system in vivo ^7.

Fig. 2. Specificitet cellytan protein märkning.

Den cellsurface proteiner CHO-K1-celler var märkta med Cy3 och fraktionerad. De olika fraktionerna var åtskilda av 2-D elektrofores och scannas för Cy3 fluorescens (A). Samma geler därefter infärgas med silver (B).

Fraktionering

Det finns endast små skillnader i stället mönstret för membran-fraktionerade prov jämfört med nonfractionated provet (Fig. 2). De två spot kartor jämfördes med DeCyder 2-D Differential Analysis Software och alla fläckar upptäckts i membranet fraktionen var också närvarande i den icke-fraktionerade prov. Fraktionering är därför inte nödvändigt att bättre upptäcka proteiner på cellens yta, men kan användas för att verifiera bristande märkning av proteiner inuti cellerna.

Jämförelse mellan protokoll

För att kunna utvärdera fördelarna med den nya cellytan proffsfett, protein märkning protokoll, en jämförelse med standarden Ettan Dige protokoll utfördes. Två identiska prover från CHO-K1 celler som odlas i samma kolv som var märkta parallellt med två olika protokoll, respektive (Fig 1). En cellytan Cy5 märkt prov kördes på samma gel som heter Cy3 cell lysat. Den gröna fläckar (Cy3) på gelen (Fig. 3A) representerar proteiner märkts med standard Ettan Dige förfarande som membran fraktionering. Dessa fläckar är förmodligen membranproteiner, inklusive proteiner på cellens yta och proteiner från membran inne i cellen (ER, Golgi, mitokondrien, och kärnan). Standard Ettan Dige märkning förfarande som följs av ett membran fraktionering steg valdes för jämförelse, eftersom det bör ge högsta sannolikheten för att upptäcka låga rikliga proteiner cellytan. Den röda fläckar (Cy 5) på gelen (Fig. 3A) är cellytan specifika proteiner märkts med det nya cellytan protokoll protein märkning som inte syns med standarden märkning förfarandet (gröna prickar). Dessutom gula prickar representerar överlappande proteiner som förekommer i båda proven antingen förfarande (Fig. 3A). En annan användbar tillämpning skulle vara att kombinera båda märkning protokollen att särskilja proteiner på cellytan från dem på intracellulära membran. Dessutom kan information om relativa förändringar i cellens yta / membranprotein nivåer efter olika stimuli följas med hjälp av både märkning tekniker samtidigt.

Fig. 3.

(A) 2-D gel bilder av en CHO-K1 Cy5 cellytan märkt prov (röda fläckar, se protokoll nr 1, figur 1) och ett membran fraktionerade Cy3 prov (gröna fläckar, se protokoll 2, figur 1) märkta enligt standard Ettan Dige protokoll köra i samma 2-D gel. (B) DeCyder 2-D Differential Analysis Software utsikt från 2-D gel visar en cellytan märkta proteinet inte syns på det standardformulär Ettan Dige protokollet.

Identifiering av proteiner på cellytan

Eftersom platsen mönster är mycket olika mellan en märkt cellytan prov och totalt protein som heter prov, var det nödvändigt att införa ett cellytan märkt spik för att matcha och identifiering av fläckarna cellytan i förberedande plats kartan. Alla cellytan proteiner hämtades. Cellytan proteiner kan vara svårt att identifiera på grund av sin låga överflöd. Själva proteinet beloppet i vissa fläckar kan vara otillräcklig för att identifiera, eftersom cellytan proteiner visuellt är berikat och inte fysiskt berikat med detta protokoll. För att underlätta framgång i att identifiera låg rikliga proteiner cellens yta, kan den förberedande mängder totalprotein att berikas för membranproteiner innan ansökan om 2-D elektrofores. I dessa CHO-celler, intracellulära membran proteiner och cellens proteiner ytan utgör ca 20% av den totala protein i cellerna. För denna celltyp, kan proteinet beloppet i fläckar potentiellt ökas med en faktor 5 genom anrikning av membranproteiner. Dessutom kommer användningen av smala intervall lutning pH IPG remsor kunna tillämpas av större mängder protein. I denna studie använde vi bara 600 protein mikrogram totalt, utan berikande för membranproteiner, och ett brett sortiment IPG band. Vi var fortfarande möjlighet att identifiera ett stort antal proteiner på cellytan, varav 82% var tidigare känd som membranet associerade proteiner.

Multiplexing

För att testa cellytan protokollet protein märkning i en Ettan Dige experiment med alla tre färgämnen ^6, en serie prover från serum utarmat CHO-celler samlades in och cellytan proteiner märks vid olika tidpunkter (Tabell 1). Proverna var åtskilda av 2-D elektrofores. Beredningen av en inre standard för en cellytan Dige experiment är enkelt. I detta fall var Cy 2 cellytan märkta prover (från alla tidpunkter) slås samman och användas som en intern standard tillämpas för varje 2-D gel. Alla tre CyDye Dige Fluor minimal färgämnen märkta cellytan proteiner liknande sätt (data visas inte). Förändringar i uttryck under serum svält för många av proteiner på cellens yta upptäcktes med hjälp av DeCyder 2-D-programvara (Fig. 4).

Fig. 4.

Förändring i uttryck av två proteiner på cellernas ytor under svält i CHO-K1-celler. Spot kartor analyserades med hjälp DeCyder 2-D Differential analysprogram.

Slutsatser

Det nya Ettan Dige protokoll för cellytan protein märkning är snabb, enkel att use och mycket specifika för märkning proteiner cellytan. Många nya cellytan proteiner är endast upptäckas när du använder cellytan protokoll protein märkning. Över 80 nya proteiner på cellernas ytor för CHO-celler har upptäckts med hjälp av DeCyder 2-D Differential analysprogram. Över 80% av de identifierade cellens märkta ytan fläckar var membranet associerade proteiner.

Multiplexing uppnås med hjälp av tre CyDye Dige Fluor minimal färgämnen, och i kombination med DeCyder 2-D mjukvara, är detta nya protokollet ett kraftfullt verktyg för att studera proteiner på cellens yta med alla de fördelar som erhålls med 2-D Dige teknik.

Materials

Name	Type	Company	Catalog Number	Comments
CyDye DIGE Kit, 2 nmol	Reagent	GE Healthcare	28-9345-30
2-D Quant Kit	Reagent	GE Healthcare	80-6484-51
IPG Buffer pH 3-11NL	Reagent	GE Healthcare	17-6004-40
Immobiline DryStrip pH 3-11NL, 24 cm	Reagent	GE Healthcare	17-6003-77
IPGbox	Tool	GE Healthcare	28-9334-65
IPGbox kit	Tool	GE Healthcare	28-9334-92
DeStreak Rehydration solution	Reagent	GE Healthcare	17-6003-19
Immobiline DryStrip Cover Fluid	Reagent	GE Healthcare	17-1335-01
Ettan IPGphor 3 IEF Unit	Instrument	GE Healthcare	11-0033-64
Ettan IPGphor Manifold	Instrument component	GE Healthcare	80-6498-38
Ettan DALTtwelve Gel Caster	Tool	GE Healthcare	80-6467-22
Ettan DALTtwelve Separation Unit and Power Supply/Control Unit	Instrument	GE Healthcare	80-6466-46	230 V unit: 80-6466-27
Typhoon 9410 Variable Mode Imager	Instrument	GE Healthcare	63-0055-81
Ettan Spot Picker	Instrument	GE Healthcare	18-1145-28
Ettan Digester	Instrument	GE Healthcare	18-1142-68
Ettan Spotter	Instrument	GE Healthcare	18-1142-67
Ettan MALDI-TOF	Instrument	GE Healthcare	18-1142-33
DeCyder 2-D Differential Analysis Software	Other	GE Healthcare	28-4012-01
ImageQuant Analysis Software	Other	GE Healthcare	28-9236-62
Urea	Reagent	GE Healthcare	17-1319-01
CHAPS	Reagent	GE Healthcare	17-1314-01
PlusOne Dithiothreitol (DTT)	Reagent	GE Healthcare	17-1318-01
Bromophenol Blue	Reagent	GE Healthcare	17-1329-01
Tris	Reagent	GE Healthcare	17-1321-01
Sodium Dodecylsulfate (SDS)	Reagent	GE Healthcare	17-1313-01
PlusOne Glycerol 87%	Reagent	GE Healthcare	17-1325-01
PlusOne ReadySol IEF 40% T, 3% C	Reagent	GE Healthcare	17-1310-01
PlusOne TEMED	Reagent	GE Healthcare	17-1312-01
PlusOne Ammonium Persulfate	Reagent	GE Healthcare	17-1311-01
PlusOne Glycine	Reagent	GE Healthcare	17-1323-01
2-D Sample Prep for membrane proteins	Reagent	Pierce, Thermo Scientific	89864
Streptomycin sulphate	Reagent	Invitrogen	15140-122