Labelling סלקטיבי של חלבונים על פני קרום התא באמצעות CyDye DIGE צבעים פלואוריד מינימלי
Summary
שיטה פשוטה ספציפי הודגם תיוג פלורסנט וזיהוי מוגברת של חלבונים פני התא ללא צעד חלוקה. שפע דיפרנציאלי חלבונים פני התא נותח באמצעות אלקטרופורזה דו מימדי (2-D) ו Ettan טכנולוגיית ™ DIGE.
Abstract
חלבונים Surface הם מרכזי ביכולתו של התא להגיב על סביבתו כדי אינטראקציה עם תאים שכנים. הם ידועים להיות מעוררים כל איתות של כמעט תאיים. יתרה מזאת, הם ממלאים תפקיד חשוב בהתאמת הסביבה טיפול תרופתי, לעתים קרובות מעורבים בהיווצרות המחלה והפתולוגיה (1). חלבונים הם אינטראקציות מהותי מסלולי איתות, ולקבל תובנה יותר אלה תהליכים ביולוגיים מורכבים, שיטות רגיש ואמין יש צורך ללמוד משטח חלבונים בתא. דו מימדי (2-D) אלקטרופורזה נעשה שימוש נרחב לגילוי של סמנים ביולוגיים ויעדים אחרים בדגימות חלבון מורכב ללמוד שינויים ההפרש. שטח פני התא חלבונים, בין היתר בשל שפע הנמוכה שלהם (1 2% של חלבונים תאיים), קשה לזהות בתוך ג'ל 2-D ללא חלוקה או סוג אחר של העשרה. לעתים קרובות הם גם ייצגו גרוע 2-D ג'לים בשל אופי הידרופובי שלהם משקל מולקולרי גבוה (2). במחקר זה, אנו מציגים פרוטוקול חדש של תאים שלמים באמצעות CyDye DIGE צבעים פלואוריד מינימלי עבור תיוג זיהוי ספציפי של קבוצה חשובה זו של חלבונים. התוצאות הראו תיוג ספציפית של מספר רב של חלבונים פני התא עם תיוג מינימלי של חלבונים תאיים. פרוטוקול זה הוא מהיר, פשוט לשימוש, וכל שלושת CyDye DIGE צבעים פלואוריד מינימלי (סי 2, סי 3 וסי 5) ניתן להשתמש בתווית על פני קרום התא חלבונים. תכונות אלו מאפשרות ריבוב באמצעות 2-D ההבדל Fluorescence ג'ל אלקטרופורזה (2-D DIGE) עם טכנולוגיית DIGE Ettan וניתוח של שינויים בביטוי החלבונים באמצעות DeCyder 2-D ניתוח תוכנה דיפרנציאלי. רמת פני קרום התא חלבונים לוותה במהלך רעב סרום של תאים CHO עבור אורכי זמן שונים (ראה טבלה 1). שינויים קטנים שפע התגלו עם דיוק גבוה, והתוצאות נתמכים על ידי שיטות סטטיסטיות מוגדר.
Protocol
Discussion
ריכוז חלבון
סקירה של שני workflows תיוג מוצג באיור 1. מאז התאים הם עדיין שלם שכותרתו כאשר על פי פרוטוקול פני קרום התא תיוג חלבון, רק פני חלבונים בתא נחשפים לצבוע. ב תקן Ettan DIGE פרוטוקול, התאים lysed לפני תיוג חלבונים בתוך כמו גם מחוץ לתא מסומנ…
Acknowledgements
אנו מודים פרופ Dontscho Kerjaschki, קורינה מיירהופר ו סיגורד קריגר במכון לפתולוגיה קלינית, אוניברסיטת וינה, אוסטריה על שיתוף הפעולה שלהם.
Materials
| Material Name | Type | Company | Catalogue Number | Comment |
|---|---|---|---|---|
| CyDye DIGE Kit, 2 nmol | Reagent | GE Healthcare | 28-9345-30 | |
| 2-D Quant Kit | Reagent | GE Healthcare | 80-6484-51 | |
| IPG Buffer pH 3-11NL | Reagent | GE Heallthcare | 17-6004-40 | |
| Immobiline DryStrip pH 3-11NL, 24 cm | Reagent | GE Healthcare | 17-6003-77 | |
| IPGbox | Tool | GE Healthcare | 28-9334-65 | |
| IPGbox kit | Tool | GE Healthcare | 28-9334-92 | |
| DeStreak Rehydration solution | Reagent | GE Healthcare | 17-6003-19 | |
| Immobiline DryStrip Cover Fluid | Reagent | GE Healthcare | 17-1335-01 | |
| Ettan IPGphor 3 IEF Unit | Instrument | GE Healthcare | 11-0033-64 | |
| Ettan IPGphor Manifold | Instrument component | GE Healthcare | 80-6498-38 | |
| Ettan DALTtwelve Gel Caster | Tool | GE Healthcare | 80-6467-22 | |
| Ettan DALTtwelve Separation Unit and Power Supply/Control Unit | Instrument | GE Healthcare | 80-6466-46 | 230 V unit: 80-6466-27 |
| Typhoon 9410 Variable Mode Imager | Instrument | GE Healthcare | 63-0055-81 | |
| Ettan Spot Picker | Instrument | GE Healthcare | 18-1145-28 | |
| Ettan Digester | Instrument | GE Healthcare | 18-1142-68 | |
| Ettan Spotter | Instrument | GE Healthcare | 18-1142-67 | |
| Ettan MALDI-TOF | Instrument | GE Healthcare | 18-1142-33 | |
| DeCyder 2-D Differential Analysis Software | Other | GE Healthcare | 28-4012-01 | |
| ImageQuant Analysis Software | Other | GE Healthcare | 28-9236-62 | |
| Urea | Reagent | GE Healthcare | 17-1319-01 | |
| CHAPS | Reagent | GE Healthcare | 17-1314-01 | |
| PlusOne Dithiothreitol (DTT) | Reagent | GE Healthcare | 17-1318-01 | |
| Bromophenol Blue | Reagent | GE Healthcare | 17-1329-01 | |
| Tris | Reagent | GE Healthcare | 17-1321-01 | |
| Sodium Dodecylsulfate (SDS) | Reagent | GE Healthcare | 17-1313-01 | |
| PlusOne Glycerol 87% | Reagent | GE Healthcare | 17-1325-01 | |
| PlusOne ReadySol IEF 40% T, 3% C | Reagent | GE Healthcare | 17-1310-01 | |
| PlusOne TEMED | Reagent | GE Healthcare | 17-1312-01 | |
| PlusOne Ammonium Persulfate | Reagent | GE Healthcare | 17-1311-01 | |
| PlusOne Glycine | Reagent | GE Healthcare | 17-1323-01 | |
| 2-D Sample Prep for membrane proteins | Reagent | Pierce | 89864 | |
| Streptomycin sulphate | Reagent | Invitrogen | 15140-122 |
References
- Jang, J. H., Hanash, S. M. Profiling of the cell surface proteome. Proteomics. 3, 1947-1954 (2003).
- Shin, B. K. Global profiling of the cell surface proteome of cancer cells uncovers an abundance of proteins with chaperone function. J Biol Chem. 9, 7607-7616 (2003).
- . Ettan DIGE System User Manual. GE Healthcare user manual 18-1164-40. , (2006).
- . DeCyder 2-D Differential Analysis Software v 6.0. GE Healthcare data file 11-0011-98 Edition AA. , (2004).
- . 2-D Electrophoresis using immobilized pH gradients, principles and methods. GE Healthcare handbook 80-6429-60 Edition AB. , (2002).
- . CyDye DIGE fluors and labeling kits. GE Healthcare data file 18-1164-84 Edition AB. , (2003).
- Mayrhofer, C., Krieger, S., Allmaier, G., Kerjaschki, D. DIGE compatible labeling of surface proteins on vital cells in vitro and in vivo. Proteomics. 2, 579-5785 (2006).
- . Selective labeling of cell-surface proteins using CyDye DIGE Fluor minimal dyes. GE Healthcare Application Note 11-0033-92 Edition AB. , (2005).
