Summary
Un metodo semplice e specifico è stato dimostrato per la marcatura fluorescente e la rilevazione maggiore di proteine di superficie cellulare, senza un passo di frazionamento. Abbondanza differenziale di proteine della superficie cellulare è stato analizzato mediante elettroforesi bidimensionale (2-D) e Ettan ™ tecnologia DIGE.
Abstract
Proteine di superficie sono fondamentali per la capacità della cellula di reagire al suo ambiente e di interagire con le cellule vicine. Essi sono noti per essere induttori di quasi tutti i segnali intracellulari. Inoltre, essi svolgono un ruolo importante nell'adattamento ambientale e trattamento farmacologico, e spesso sono coinvolti nella patogenesi della malattia e patologia (1). Interazioni proteina-proteina sono intrinseche vie di segnalazione, e per ottenere un quadro più chiaro in questi complessi processi biologici, metodi sensibili e affidabili sono necessari per lo studio delle proteine di superficie delle cellule. Bidimensionale (2-D) elettroforesi è ampiamente utilizzato per il rilevamento dei biomarcatori e altri obiettivi in campioni di proteine complesse per studiare i cambiamenti differenziale. Proteine di superficie cellulare, in parte a causa della loro abbondanza basso (1 2% di proteine cellulari), sono difficili da individuare in un 2-D gel senza frazionamento o qualche altro tipo di arricchimento. Sono anche spesso poco rappresentati in 2-D gel a causa della loro natura idrofobica e ad alto peso molecolare (2). In questo studio, presentiamo un nuovo protocollo per le cellule intatte mediante CyDye DIGE coloranti Fluor minimi specifici per l'etichettatura e la rilevazione di questo importante gruppo di proteine. I risultati hanno mostrato specifici dell'etichettatura di un gran numero di proteine di superficie delle cellule con l'etichettatura minimo di proteine intracellulari. Questo protocollo è rapido, semplice da usare, e tutti CyDye tre DIGE coloranti Fluor minima (Cy 2, 3 e Cy Cy 5) può essere usato per etichettare superficie cellulare delle proteine. Queste caratteristiche consentono di multiplexing utilizzando il 2-D elettroforesi su gel a fluorescenza Differenza (2-D DIGE) con tecnologia DIGE Ettan e l'analisi dei cambiamenti dell'espressione proteica con DeCyder 2-D Software differenziale di analisi. Il livello di superficie cellulare delle proteine è stato seguito durante il digiuno nel siero di cellule CHO per varie lunghezze di tempo (vedi tabella 1). Piccoli cambiamenti in abbondanza sono stati rilevati con elevata precisione, ed i risultati sono supportati da definire metodi statistici.
Protocol
Coltura cellulare
- Crescere le cellule ovariche di criceto cinese (CHO-K1) utilizzando le procedure standard di coltura cellulare in F-12 di media Ham con GlutaMAX ho contenente il 10% di siero fetale bovino, 50 U / ml di penicillina, e 50 mg / ml di streptomicina solfato (Invitrogen).
- Scambio terreno di coltura di siero di supporti liberi. Etichetta proteine di superficie della cellula erano in diversi momenti con CyDye DIGE Fluor Cy3 o Cy5 coloranti minima (vedi cellulare Etichettatura sezione di superficie, sotto).
- Un numero uguale di cellule piscina da ogni punto di tempo e l'etichetta con CyDye DIGE Fluor Cy2. Utilizzare questi come standard interno per ogni 2-D gel.
- La maggior parte degli esperimenti può essere effettuata con cellule CHO-K1, ma fibroblasti embrione di topo (L1 3T3) e ascite linfoma di topo linfoblasti (EL4) può anche essere usato (dati non riportati).
- Crescono i due tipi di cellule quest'ultimo in DMEM media con GlutaMAX II, ma, in caso contrario, l'uso identiche condizioni utilizzate per la cellule CHO-K1.
Superficie cellulare etichettatura
- Con attenzione staccare cellule aderenti non-enzimaticamente, il conteggio e la divisione in aliquote di 5-10 x 106 cellule. Per le cellule crescono in sospensione, omettere il passaggio distacco.
- Centrifugare la sospensione cellulare a circa 800 xg per 5 minuti. Rimuovere il surnatante contenente il mezzo.
- Lavare il pellet da resuspendion in soluzione salina bilanciata 1 ml ghiacciata di Hank (HBSS) pH 8.5. Centrifugato a 800 xg a 4 ° C per 2 minuti.
- Rimuovere il supernatante e risospendere il pellet cellulare in 200 microlitri di buffer etichettatura ghiacciata (HBSS pH 8,5, 1 M urea).
- Etichetta le cellule intatte con 600 pmol CyDye DIGE coloranti Fluor minimo per 20 minuti in ghiaccio al buio.
- Placare la reazione aggiungendo 20 l 10 mM lisina. Incubare per 10 minuti.
- Lavare la superficie marcato le cellule due volte da risospensione in 500 microlitri HBSS pH 7,4, seguita da centrifugazione a 800 xg a 4 ° C per 2 minuti.
Lisi cellulare e frazionamento
- Lisare la superficie marcata con cellule in 150 microlitri di buffer di lisi freddo (7 M urea, 2 M tiourea, 4% CHAPS, 30 mM Tris, 5 mM acetato di magnesio pH 8,5). Lasciare in ghiaccio per almeno 1 h con vortex occasionali.
- Centrifugare il lisato a 10 000 xga 4 ° C per 5 minuti. Trasferire il surnatante in una nuova provetta. Questo esempio è il non-frazionata campione che contiene tutte le proteine cellulari.
- In parallelo, lavare pellet cellulari, come sopra, poi frazionare (utilizzando un kit di frazionamento membrana, Pierce) in frazioni di membrana e citosolici prima di 2-D elettroforesi su gel. La frazione membrana interna e contiene proteine di membrana delle cellule di superficie.
- Per confronto, seguire la procedura standard di Ettan DIGE 3 e lisare, etichetta, e, infine, frazionare le cellule. Determinare la concentrazione di proteine nei campioni con il 2 - D Quant Kit (GE Healthcare).
2-D elettroforesi
- Reidratare gel DryStrip Immobiline, pH 3-11NL (24 cm) con vassoio Immobiline DryStrip Reswelling, 24 cm in 450 ul di soluzione di reidratazione DeStreak (0,5% IPG buffer) durante la notte.
- Applicare il CyDye marcato campioni (corrispondenti a 50 mg di proteine totali) per Immobiline gel DryStrip caricando coppa anodica nel collettore ed eseguire focalizzazione isoelettrica (IEF) utilizzando Ettan IPGphor II sistema IEF secondo le istruzioni.
- Dopo IEF, equilibrare le strisce in due fasi e posto sulla cima di grandi dimensioni (26 x 20 cm) 12,5% gel di poliacrilammide (SDS-PAGE). Sovrapposizione con il 0,5% agarosio (in esecuzione tampone contenente blu di bromofenolo). Run 2-D elettroforesi usando Ettan DALTtwelve grande sistema verticale a 5 W / gel per 30 minuti, e poi a 15 W / gel fino a quando il fronte del colorante raggiunge il fondo del gel.
Imaging e analisi dei dati
- Dopo aver completato 2-D elettroforesi, la scansione del gel per Cy2, Cy3 o Cy5 utilizzando un tifone 9410 Imager Variable Mode.
- Confrontare le mappe posto da frazioni di membrana, frazioni citosoliche, e non frazionato campioni utilizzando DeCyder 2-D Software differenziale Analisi 4.
Post-colorazione
- Dopo l'imaging, l'argento macchia i gel secondo procedura standard 5.
Identificazione delle proteine
- Coltivare, raccogliere, lavare e lisare quantità preparativa (circa 1 mg di proteine totali da 10 x 106 cellule CHO) di cellule, come descritto in precedenza per un non-frazionata campione. Utilizzare un Cy5 campione superficie cellulare etichettati (vedi sopra) come una punta, e applicare insieme agli importi senza etichetta preparativo di proteine.
- Eseguire l'elettroforesi 2-D come sopra descritto, ma questa volta, strofinavano 600 mg di cellule senza etichetta lisato insieme con 50 mg superficie delle cellule etichettate picco con l'applicazione anodica tazza. Usare i marcatori di riferimento per consentire la raccolta corretta posizione, e il luogo esseretra le lastre di vetro prima del getto gel seguendo le raccomandazioni 3.
- Scansione il gel in Cy5 canale per ottenere la superficie Cy5 mappa cellula posto, seguita dalla colorazione delle proteine totali con profonda proteine totali macchia viola 3.
- Corrispondenza insieme le due mappe spot utilizzando la DeCyder 2-D di software e creare un elenco di tutti i punti corrispondenti ai 5 proteine cellulari Cy etichettati superficie. Scegli le proteine della superficie cellulare utilizzando il punto stazione Ettan manipolazione, estratto le spine gel, e trypsinate utilizzando il digestore Ettan. Identificare con MALDI-TOF spettrometria di massa.
Tabella 1. Un esperimento Ettan DIGE è stata effettuata utilizzando campioni di siero di cellule impoverito etichettati secondo la superficie cellulare protocollo di etichettatura delle proteine in figura 1.
| Campione | Tempo di esaurimento siero | Etichettato con CyDye | Gel numero |
| 1 | - | Cy 3, Cy 2 | 1 |
| 2 | 30 minuti | Cy 5, Cy 2 | 1 |
| 3 | 2 ore | Cy 3, Cy 2 | 2 |
| 4 | 4 ore | Cy 5, Cy 2 | 2 |
| 5 | 16 ore | Cy 5, Cy 2 | 3 |
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Discussion
Concentrazione di proteine
Una panoramica dei due flussi di lavoro di etichettatura è illustrato nella figura 1. Dal momento che le cellule sono ancora intatte quando etichettati secondo la superficie cellulare protocollo proteina etichettatura, solo le proteine della superficie cellulare sono esposti al colorante. Nello standard Ettan DIGE protocollo, le cellule sono lisate prima di etichettatura e di proteine all'interno e all'esterno della cellula sono etichettati (Fig. 1). La quantità relativa di colorante alle proteine della superficie cellulare protocollo proteine sull'etichetta non è noto, dal momento che le proteine della superficie cellulare non possono essere specificamente quantificato. Tuttavia, è noto che le proteine della superficie cellulare rappresentano una percentuale molto bassa di proteine cellulari 2. Circa 5-10 x10 6 celle a 600 pmol di tintura sono stati utilizzati. E 'possibile utilizzare un minor numero di cellule in quanto solo 12,5-25% del campione nonfractionated in questo studio è stato usato per l'elettroforesi 2-D.
Fig. 1. Panoramica di etichettatura protocolli del flusso di lavoro
Concentrazioni di proteine nelle diverse frazioni sono stati determinati utilizzando il 2-D Kit Quant. La quantità totale di proteine derivate da 10 x10 6 cellule CHO-K1 920 mg è stato nel non-frazionata campione, 225 mg in membrana mcg / frazione idrofobica e 770 nella frazione citosolica / idrofile. Tali importi molto probabilmente variano a seconda del tipo di cellula e le dimensioni delle cellule. La percentuale di proteine che sono etichettati nella superficie cellulare protocollo può essere superiore rispetto allo standard di etichettatura Ettan DIGE minima, che è il 2-3% delle proteine totali. Sembra che solo una molecola del colorante è fissata per molecola proteica, dal momento che la forma spot è rotondo e striature verticali delle proteine a basso molecolare del gel è assente (Fig. 2 e 3). Due o più molecole di colorante per le proteine potrebbe causare striature verticali a causa di un aumento del peso molecolare della proteina etichettati. Questo fenomeno potrebbe essere visto per lo più con le proteine a basso peso molecolare, dal momento che un cambiamento nel peso molecolare di queste proteine si tradurrebbe in uno spostamento più ampio sul gel rispetto alle proteine ad alto peso molecolare.
Superficie cellulare di proteine specifiche di etichettatura
Due campioni identici di superficie le cellule sono state etichettate con CyDye DIGE Fluor Cy3. Uno era lisati ed utilizzati direttamente per 2-D elettroforesi. L'altro campione era lisati e frazionato in membrana e frazioni citosoliche. L'intera etichetta fluorescente apparso nella frazione di membrana, la frazione citosolica era privo di proteine marcate (Fig. 2). Il gel stesso con il campione di proteina citoplasmatica era macchiata d'argento e il risultato ha mostrato che vi erano le proteine nel gel, ma non erano etichettati con superficie cellulare protocollo etichettatura delle proteine. Questi risultati suggeriscono che questo protocollo nuova etichettatura è specifico per le proteine della superficie cellulare. Il CyDye DIGE colorante Fluor minimo non sembra entrare nella cellula o passare attraverso la membrana cellulare. Le cellule sono tenuti in ghiaccio prima di etichettatura, e questo può ridurre qualsiasi attività di trasporto attraverso la membrana. Il tempo di esposizione CyDye DIGE colorante Fluor minima è relativamente breve (20 minuti), il che è sufficiente per l'etichettatura di proteine, ma non per l'ingresso nella cellula. Un'altra spiegazione possibile per la mancanza di etichettatura all'interno della cellula è che anche se il colorante passa attraverso la membrana, il pH all'interno della cellula è troppo bassa (<pH 7,4) per una reazione efficace di etichettatura a verificarsi (pH ottimale 8,5). La reazione di marcatura è spento seguito dal lavaggio delle cellule, che impedisce ulteriormente l'etichettatura proteina dopo che le cellule sono state lisate. Questo metodo è stato applicato con successo a linee di cellule umane in vitro nonché di un sistema biologico complesso in vivo 7.
Fig. 2. Specificità della superficie cellulare etichettatura delle proteine.
Le proteine cellsurface di cellule CHO-K1 sono stati etichettati con Cy3 e frazionato. Le diverse frazioni erano separati da 2-D elettroforesi, la ricerca di Cy3 fluorescenza (A). Il gel stessa sono stati poi colorati in argento (B).
Frazionamento
Ci sono solo piccole differenze nel modello di spot per la membrana-frazionata del campione rispetto al campione nonfractionated (Fig. 2). Le due mappe posto sono stati confrontati con DeCyder 2-D Software differenziale Analisi e tutti i punti individuati nella frazione di membrana erano presenti anche nel settore non-frazionata campione. Frazionamento, quindi, non è necessario per migliorare la rilevazione di proteine della superficie cellulare, ma può essere utilizzato per verificare la mancanza di etichettatura delle proteine all'interno delle cellule.
Confronto tra protocolli
Per essere in grado di valutare i vantaggi con il nuovo pro superficie cellulareTEIN etichettatura protocollo, un confronto con lo standard Ettan DIGE protocollo è stato eseguito. Due campioni identici da CHO-K1 cellule coltivate nella stessa beuta sono stati etichettati in parallelo con i due protocolli differenti, rispettivamente (Fig. 1). Una superficie cellulare Cy5 campione marcato è stato eseguito sul gel come un lisato Cy3 cella etichettata. Le macchie verdi (Cy3) sul gel (Fig. 3A) rappresentano le proteine etichettati utilizzando la procedura standard di DIGE Ettan seguito da frazionamento membrana. Queste macchie sono presumibilmente proteine di membrana tra cui proteine di superficie delle cellule e le proteine dalla membrana all'interno della cellula (ER, Golgi, mitocondri e nucleo). Standard Ettan procedura di etichettatura DIGE seguito da un passo di frazionamento membrana è stato scelto per il confronto, dal momento che devono dare la massima probabilità di rilevare la bassa abbondanti proteine di superficie delle cellule. Le macchie rosse (Cy 5) sul gel (Fig. 3A) della superficie cellulare sono proteine specifiche etichettati utilizzando il nuovo protocollo di superficie delle cellule delle proteine di etichettatura che non sono visibili con la procedura di etichettatura standard (punti verdi). Inoltre, le macchie gialle rappresentano le proteine di sovrapposizione che si verificano in entrambi i campioni utilizzando procedura (Fig. 3A). Un'altra applicazione utile potrebbe essere quella di combinare entrambi i protocolli di etichettatura per distinguere le proteine sulla superficie delle cellule da quelle sulle membrane intracellulari. Inoltre, informazioni sulle variazioni relative nella cella superficie / membrana livelli di proteine, dopo vari stimoli potrebbe essere seguita utilizzando sia tecniche di etichettatura contemporaneamente.
Fig. 3.
(A) 2-D gel immagini di un CHO-K1 Cy5 superficie cellulare del campione marcato (macchie rosse, si veda il protocollo 1, Fig. 1) e una membrana frazionato Cy3 campione (macchie verdi, si veda il protocollo 2, Fig. 1) etichettati secondo le standard di Ettan DIGE protocollo eseguire nello stesso 2-D gel. (B) DeCyder 2-D differenziale visualizzazioni di analisi software dal 2-D gel che mostra una superficie cellulare proteina marcata non visibile utilizzando lo standard Ettan DIGE protocollo.
Identificazione delle proteine di superficie cellulare
Dal momento che il modello posto è molto diverso tra una superficie cella etichettata campione e un campione di proteine totali etichettati, è stato necessario includere una superficie cellulare etichettato picco per permettere di corrispondenza e l'identificazione dei punti della superficie della cella nella mappa delle località preparativo. Tutte le proteine della superficie delle cellule sono state raccolte. Proteine di superficie cellulare possono essere difficili da identificare a causa della loro abbondanza basso. La quantità di proteine effettivamente in alcuni punti potrebbero essere sufficienti per l'identificazione, dal momento che le proteine di superficie cellulare sono visivamente arricchiti e non fisicamente arricchito utilizzando questo protocollo. Per facilitare l'identificazione di successo di proteine cellulari a basso abbondante superficie, gli importi preparativa delle proteine totali può essere arricchito di proteine di membrana prima applicazione su 2-D elettroforesi. In queste cellule CHO, proteine di membrana intracellulari e proteine di superficie delle cellule costituiscono circa il 20% delle proteine totali nelle cellule. Per questo tipo di cellule, l'importo delle proteine nei punti potrebbe essere aumentato di un fattore 5 per l'arricchimento di proteine di membrana. Inoltre, l'uso di intervalli ristretti di pH pendenza delle strisce IPG permetterà l'applicazione di grandi quantità di proteine. In questo studio abbiamo usato solo 600 mg di proteine totali, senza alcun arricchimento per proteine di membrana, e una larga striscia di IPG gamma. Eravamo ancora in grado di identificare un gran numero di proteine di superficie cellulare, di cui l'82% era precedentemente conosciuta come membrana proteine associate.
Multiplexing
Per testare la superficie delle cellule delle proteine protocollo di etichettatura in un esperimento DIGE Ettan utilizzando tutti e tre i coloranti 6, una serie di campioni di siero impoverito cellule CHO sono stati raccolti e proteine della superficie cellulare etichettato in diversi momenti (Tabella 1). I campioni sono stati separati da 2-D elettroforesi. La preparazione di uno standard interno per un esperimento DIGE superficie cellulare è semplice. In questo caso, Cy 2 campioni della superficie cellulare etichettati (da tutti i punti di tempo) sono stati raccolti e utilizzati come standard interno applicato a ogni 2-D gel. Superficie cellulare tutti CyDye tre DIGE coloranti Fluor minimo etichettati proteine in modo simile (dati non riportati). Cambiamenti nell'espressione durante il digiuno nel siero per molti di proteine di superficie delle cellule sono state rilevate utilizzando DeCyder 2-D software (Fig. 4).
Fig. 4.
Cambiamento di espressione di due proteine di superficie cellulare durante il digiuno di cellule CHO-K1. Mappe spot sono stati analizzati utilizzando DeCyder 2-D differenziale software di analisi.
Conclusioni
Il nuovo protocollo Ettan DIGE per l'etichettatura delle proteine della superficie cellulare è rapido, semplice da use e altamente specifico per l'etichettatura proteine di superficie delle cellule. Molti romanzo proteine della superficie cellulare sono rilevabili solo quando si utilizza la superficie cellulare protocollo di etichettatura delle proteine. Più di 80 nuove proteine di superficie cellulare di cellule CHO sono stati rilevati utilizzando DeCyder 2-D Software differenziale di analisi. Oltre l'80% dei posti cella identificata superficie sono stati etichettati proteine di membrana associate.
Multiplexing si ottiene utilizzando il CyDye tre DIGE coloranti Fluor minimo, e in combinazione con DeCyder 2-D del software, questo nuovo protocollo è un potente strumento per lo studio delle proteine di superficie cellulare con tutti i vantaggi ottenuti con la 2-D DIGE tecnologia.
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Acknowledgments
Ringraziamo il professor Dontscho Kerjaschki, Corina Mayrhofer e Sigurd Krieger presso l'Istituto di Patologia Clinica, Università di Vienna, in Austria per la collaborazione.
Materials
| Name | Type | Company | Catalog Number | Comments |
| CyDye DIGE Kit, 2 nmol | Reagent | GE Healthcare | 28-9345-30 | |
| 2-D Quant Kit | Reagent | GE Healthcare | 80-6484-51 | |
| IPG Buffer pH 3-11NL | Reagent | GE Healthcare | 17-6004-40 | |
| Immobiline DryStrip pH 3-11NL, 24 cm | Reagent | GE Healthcare | 17-6003-77 | |
| IPGbox | Tool | GE Healthcare | 28-9334-65 | |
| IPGbox kit | Tool | GE Healthcare | 28-9334-92 | |
| DeStreak Rehydration solution | Reagent | GE Healthcare | 17-6003-19 | |
| Immobiline DryStrip Cover Fluid | Reagent | GE Healthcare | 17-1335-01 | |
| Ettan IPGphor 3 IEF Unit | Instrument | GE Healthcare | 11-0033-64 | |
| Ettan IPGphor Manifold | Instrument component | GE Healthcare | 80-6498-38 | |
| Ettan DALTtwelve Gel Caster | Tool | GE Healthcare | 80-6467-22 | |
| Ettan DALTtwelve Separation Unit and Power Supply/Control Unit | Instrument | GE Healthcare | 80-6466-46 | 230 V unit: 80-6466-27 |
| Typhoon 9410 Variable Mode Imager | Instrument | GE Healthcare | 63-0055-81 | |
| Ettan Spot Picker | Instrument | GE Healthcare | 18-1145-28 | |
| Ettan Digester | Instrument | GE Healthcare | 18-1142-68 | |
| Ettan Spotter | Instrument | GE Healthcare | 18-1142-67 | |
| Ettan MALDI-TOF | Instrument | GE Healthcare | 18-1142-33 | |
| DeCyder 2-D Differential Analysis Software | Other | GE Healthcare | 28-4012-01 | |
| ImageQuant Analysis Software | Other | GE Healthcare | 28-9236-62 | |
| Urea | Reagent | GE Healthcare | 17-1319-01 | |
| CHAPS | Reagent | GE Healthcare | 17-1314-01 | |
| PlusOne Dithiothreitol (DTT) | Reagent | GE Healthcare | 17-1318-01 | |
| Bromophenol Blue | Reagent | GE Healthcare | 17-1329-01 | |
| Tris | Reagent | GE Healthcare | 17-1321-01 | |
| Sodium Dodecylsulfate (SDS) | Reagent | GE Healthcare | 17-1313-01 | |
| PlusOne Glycerol 87% | Reagent | GE Healthcare | 17-1325-01 | |
| PlusOne ReadySol IEF 40% T, 3% C | Reagent | GE Healthcare | 17-1310-01 | |
| PlusOne TEMED | Reagent | GE Healthcare | 17-1312-01 | |
| PlusOne Ammonium Persulfate | Reagent | GE Healthcare | 17-1311-01 | |
| PlusOne Glycine | Reagent | GE Healthcare | 17-1323-01 | |
| 2-D Sample Prep for membrane proteins | Reagent | Pierce, Thermo Scientific | 89864 | |
| Streptomycin sulphate | Reagent | Invitrogen | 15140-122 |
References
- Jang, J. H., Hanash, S. M. Profiling of the cell surface proteome. Proteomics. 3, 1947-1954 (2003).
- Shin, B. K. Global profiling of the cell surface proteome of cancer cells uncovers an abundance of proteins with chaperone function. J Biol Chem. 9, 7607-7616 (2003).
- Ettan DIGE System User Manual. GE Healthcare user manual 18-1164-40. , (2006).
- DeCyder 2-D Differential Analysis Software v 6.0. GE Healthcare data file 11-0011-98 Edition AA. , (2004).
- 2-D Electrophoresis using immobilized pH gradients, principles and methods. GE Healthcare handbook 80-6429-60 Edition AB. , (2002).
- CyDye DIGE fluors and labeling kits. GE Healthcare data file 18-1164-84 Edition AB. , (2003).
- Mayrhofer, C., Krieger, S., Allmaier, G., Kerjaschki, D. DIGE compatible labeling of surface proteins on vital cells in vitro and in vivo. Proteomics. 2, 579-5785 (2006).
- Selective labeling of cell-surface proteins using CyDye DIGE Fluor minimal dyes. GE Healthcare Application Note 11-0033-92 Edition AB. , (2005).
