Селективный маркировки на поверхности клеток белков, используя CyDye ПГЛП Fluor Минимальная Красители

Summary

Простой и конкретный метод был продемонстрирован для флуоресцентной маркировки и усовершенствованные функции обнаружения белков клеточной поверхности, без фракционирования шаг. Дифференциальная обилие белков клеточной поверхности, были проанализированы с использованием двумерных (2-D), электрофорез и Ettan ™ ПГЛП технологии.

Abstract

Поверхностные белки играют центральную роль в способности клеток к реагируют на окружающую среду и взаимодействие с соседними клетками. Они, как известно, индукторы практически всех внутриклеточных сигнальных. Более того, они играют важную роль в экологической адаптации и лечения наркозависимости, и часто участвует в патогенезе заболевания и патологии (1). Белок-белковые взаимодействия присущи сигнальных путей, а также получить более глубокое в этих сложных биологических процессов, чувствительных и надежных методов, необходимых для изучения белков клеточной поверхности. Двумерные (2-D) электрофореза широко используется для обнаружения биомаркеров и другие цели в сложных образцов белков изучать дифференциальные изменения. Сотовые поверхностных белков, частично из-за их низкой численности (1 2% клеточных белков), которые трудно обнаружить в 2-D гель без фракционирования или какой-либо другой тип обогащения. Они также часто слабо представлены в 2-D гелями из-за их гидрофобной природы и высокой молекулярной массой (2). В этом исследовании мы представляем новый протокол для нетронутыми клетки, используя CyDye ПГЛП Fluor минимальным красители для конкретной маркировки и обнаружения этой важной группы белков. Результаты показали, конкретных маркировки большого количества белков клеточной поверхности с минимальной маркировки внутриклеточных белков. Этот протокол является быстрым, простым в использовании, и все три CyDye ПГЛП Fluor минимальным красителей (Су 2, 3 и Су Су 5) может быть использован для обозначения на поверхности клеток белков. Эти функции позволяют мультиплексирования использованием 2-D флуоресцентный гель-электрофореза Разница (2-D ПГЛП) с Ettan ПГЛП технологии и анализ экспрессии белка изменения с помощью DeCyder 2-D Дифференциальный анализ программного обеспечения. Уровень поверхности клеток белков последовало во время сыворотке голодание клеток СНО для различных периодов времени (см. Таблицу 1). Небольшие изменения в изобилии были обнаружены с высокой точностью, и результаты поддерживаются определены статистические методы.

Protocol

Клеточные культуры

1. Рост китайского хомячка яичников клеток (СНО-К1) с использованием стандартных процедур культур клеток, в F-12 Хэм среде с GlutaMAX Я, содержащей 10% эмбриональной телячьей сыворотки, 50 ед / мл пенициллина, 50 мкг / мл стрептомицина сульфат (Invitrogen).
2. Биржа питательной среды для бессывороточной СМИ. Этикетка белков клеточной поверхности, были в различные моменты времени с CyDye ПГЛП Fluor Cy3 или Cy5 минимальным красителей (см. раздел клеточной поверхности, маркировки, ниже).
3. Бассейн равное количество клеток из каждой точки времени и этикетка с CyDye ПГЛП Fluor Су2. Используйте их в качестве внутреннего стандарта для каждого 2-D геле.
4. Большинство экспериментов могут быть выполнены с СНО-К1 клетки, но мышиных эмбриональных фибробластов (3T3 L1) и мышь асцит лимфомы лимфобластов (EL4) также может использоваться (данные не приведены).
5. Рост последних двух типов клеток в DMEM среде с GlutaMAX II, но, в противном случае используйте одинаковые условия для CHO-K1 клеток.

Маркировки на поверхности клетки

1. Аккуратно отделить прилипшие клетки неферментативно, подсчета и деления на аликвоты 5-10 x106 клеток. Для клеток, растущих в виде суспензии, опустите отсоединения шаг.
2. Центрифуга клеточные суспензии около 800 мкг в течение 5 минут. Удалить надосадочную жидкость содержащие среды.
3. Вымойте окатышей resuspendion в Сбалансированный Соль 1 мл ледяной Хэнка Решение (HBSS) рН 8,5. Центрифугировали при 800 мкг при 4 ° С в течение 2 минут.
4. Удалить супернатант и ресуспендируют осадок клеток в 200 мкл буфера ледяной маркировки (HBSS рН 8,5, 1 М мочевина).
5. Этикетка неповрежденных клетках с 600 пмоль CyDye ПГЛП Fluor минимальным красителей в течение 20 минут на льду в темноте.
6. Quench реакцию добавлением 20 мкл 10 мМ лизина. Инкубируйте в течение 10 минут.
7. Вымойте поверхность-меченых клеток дважды ресуспендирования в 500 мкл HBSS рН 7,4, с последующим центрифугированием при 800 мкг при 4 ° С в течение 2 минут.

Лизису клеток и фракционирования

1. Lyse поверхностно-меченых клеток в 150 мкл холодного буфера для лизиса (7 М мочевины, 2 М тиомочевины, 4% CHAPS, 30 мМ Трис, 5 мМ ацетат магния рН 8,5). Оставьте на льду в течение не менее 1 ч с редкими вортексе.
2. Центрифуга лизатов при 10 000 мкг при 4 ° С в течение 5 минут. Передача супернатант в новую пробирку. Этот образец не-фракционированного образца, содержащего всех клеточных белков.
3. Параллельно с этим, мыть ячейки гранул, как и выше, то фракционирования (при использовании комплекта мембраны фракционирования, Пирс) в мембране и цитоплазме фракций до 2-D электрофореза геля. Мембранной фракции содержит внутренние и клеточных поверхностных белков мембран.
4. Для сравнения, следуйте стандартной процедуре Ettan ПГЛП ³ и лизировать, этикетки, и, наконец, фракционирования клеток. Определить концентрацию белка в образцах с помощью 2 - D Квант Kit (GE Healthcare).

2-D электрофореза

1. Увлажняет Immobiline DryStrip гели, рН 3-11NL (24 см) с использованием Immobiline DryStrip Reswelling лоток, 24 см в 450 мкл раствора Регидратация DeStreak (0,5% IPG буфера) в течение ночи.
2. Применить CyDye меченные образцы (соответствует 50 мкг общего белка), чтобы Immobiline DryStrip гелей анодной загрузки кубок в многообразии и выполнять изоэлектрофокусировки (МЭФ), используя Ettan IPGphor II МЭФ системы в соответствии с инструкциями.
3. После МЭФ, равновесие полосы в два этапа и место на вершине большой (26 х 20 см) 12,5% полиакриламидном геле (SDS-PAGE). Наложение с 0,5% агарозы (в беге буфер, содержащий бромфенола синий). Выполнить 2-D электрофореза использованием Ettan DALTtwelve Большие вертикальные системы на 5 Вт / геля в течение 30 минут, а затем на 15 Вт / гель, пока краситель фронт достигнет нижней части геля.

Изображений и анализа данных

1. После завершения 2-D электрофореза, сканирования гелей для Су2, Cy3 или Cy5 использованием Тайфун 9410 Переменная Imager режиме.
2. Сравните месте карты из мембранных фракций, цитозольного фракций, а не-фракционированного образцов с использованием DeCyder 2-D Дифференциальный анализ программного обеспечения ^4.

После окрашивания

1. После обработки изображений, серебряные пятна гели согласно стандартной процедуре ^5.

Белки идентификации

1. Расти, урожай, мойки и лизировать препаративных количествах (примерно 1 мг общего белка от 10 x106 клетки СНО) клеток, как описано выше для не-фракционированного образца. Используйте Cy5 поверхности клетки помечены образца (см. выше), шип, а также применять вместе с немеченого препаративных количествах белка.
2. Проведение 2-D электрофореза, как описано выше, но на этот раз, aplly 600 мкг немеченого Клеточный лизат вместе с 50 мкг поверхности клетки помечены шип с применением анодного чашку. Используйте ссылки маркеров, чтобы правильный выбор места, и место бытьмежду стеклянными пластинами, прежде чем гель литья в соответствии с рекомендациями ^3.
3. Сканирование геля в Cy5 канала для получения Cy5 поверхности клетки месте карты, после чего общая окраска белка использованием Deep Purple белка общего пятно ^3.
4. Матч вместе второе место карты, используя DeCyder 2-D программное обеспечение и создать список выбора для всех пятен, соответствующих Cy 5 меченых белков клеточной поверхности. Pick поверхности клеток белков, используя обработку Ettan месте станции, выписка из геля пробок и trypsinate использованием реактора Ettan. Определить использованием MALDI-TOF масс-спектрометрии.

Таблица 1. Эксперимент Ettan ПГЛП проводилось с использованием образцов сыворотки обедненного клетки помечены в соответствии с поверхности клеток белков маркировки протокола на рисунке 1.

Образец	Время сыворотке истощения	Маркируется CyDye	Гель номер
1	-	Cy 3, Cy 2	1
2	30 минут	Cy 5, Су 2	1
3	2-х часов	Cy 3, Cy 2	2
4	4 часа	Cy 5, Су 2	2
5	16 часов	Cy 5, Су 2	3

Discussion

Концентрация белка

Обзор двух рабочих процессов маркировки показан на рисунке 1. Поскольку клетки остаются нетронутыми, когда маркированный в соответствии со клеточной поверхности протокол маркировки белка, только белки клеточной поверхности, подвержены красителя. В стандартном Ettan ПГЛП протокол, клетки лизируют до маркировки и белков внутри, так и вне клетки помечены (рис. 1). Относительное количество красителя белка в клеточной поверхности протокол маркировки белка не известно, так как на поверхности клеток белков не могут быть конкретно количественно. Тем не менее, известно, что белки клеточной поверхности являются очень низкая доля клеточных белков ^2. Примерно 5-10 x10 ^{6 клеток} до 600 пмоль красителя были использованы. В некоторых случаях можно использовать меньшее число клеток, так как только 12.5-25% от nonfractionated образец в этом исследовании был использован для 2-D электрофореза.

Рис 1. Обзор маркировки рабочих протоколов

Концентрации белка в различных фракций определяли с помощью 2-D Квант Kit. Общее количество белка, полученного из 10 x10 ⁶ CHO-K1 клеток 920 мкг в не-фракционированного образца, 225 мкг в мембране / гидрофобной фракции и 770 мкг в цитозольного / гидрофильная фракция. Эти суммы, скорее всего, меняться в зависимости от типа клеток и их размер. Доля белков, которые помечены в клеточной поверхности протокол может быть выше, чем стандартные Ettan ПГЛП минимальным маркировка, которая составляет 2-3% от общего белка. Кажется, что только одна молекула красителя крепится на молекулу белка, так как пятно формы круглые и вертикальных полос из низкомолекулярных белков на гелях отсутствует (рис. 2 и 3). Два и более молекул красителя в белок может вызвать вертикальные штрихи в связи с увеличением молекулярного веса меченых белков. Это явление будет в основном рассматриваться с низкомолекулярные белки, так как изменение молекулярной массы этих белков может привести к большим сдвигом по сравнению с гелем высокомолекулярных белков.

Cell-поверхностного белка конкретных маркировки

Два идентичных образцов клетки поверхностного помечены CyDye ПГЛП Fluor Cy3. Один из них был лизируются и использовать непосредственно для 2-D электрофореза. Другой образец лизируются и фракционированного в мембране и цитоплазме фракций. Весь флуоресцентной метки появились в мембранной фракции; цитозольного фракции лишены каких-либо меченых белков (рис. 2). Же гель с цитозольного образец белка серебра окрашенных и результат показал, что существуют белки в геле, но они не были помечены использованием клеточной поверхности белка маркировки протокола. Эти результаты позволяют предположить, что этот новый протокол маркировки является специфичным для белков клеточной поверхности. CyDye ПГЛП Fluor минимальным красителя, кажется, не проникают в клетку или проходят через клеточную мембрану. Клетки находятся на льду до маркировки и это может уменьшить любой транспорт через мембрану. Время CyDye ПГЛП Fluor минимальным воздействием красителя также относительно короткий (20 минут), что является достаточным для белка маркировки, но не для вступления в клетке. Другим возможным объяснением отсутствия маркировки внутри клетки, что даже если краска проходит через мембрану, рН внутри клетки является слишком низкой (<рН 7,4), для эффективной реакции маркировки происходить (оптимальное рН 8,5). Маркировки реакцию гасят с последующей промывкой клеток, которые в дальнейшем предотвращает белок маркировки после клетки были разрушается. Этот метод был успешно применен для человеческих клеточных линий в пробирке, а также сложные биологические системы в естественных условиях ^7.

Рис 2. Специфика поверхности клеток белков маркировки.

Cellsurface белки СНО-К1 клетки были помечены Cy3 и фракционированного. Различных фракций были разделены на 2-D электрофореза и проверяться на Cy3 флуоресценции (А). Же гели затем окрашивали серебром (B).

Фракционирование

Есть лишь незначительные различия в месте шаблон для мембранно-фракционированного образца по сравнению с nonfractionated образца (рис. 2). Две карты месте сравнивали с помощью DeCyder 2-D Дифференциальный анализ программного обеспечения и все пятна обнаружены в мембранной фракции также присутствовали в не-фракционированного образца. Фракционирование, следовательно, нет необходимости улучшения выявления белков клеточной поверхности, но может быть использована для проверки отсутствия маркировки белков внутри клетки.

Сравнение протоколов

Чтобы иметь возможность оценить преимущества новой про клеточной поверхностибелка маркировки протокол, по сравнению с стандартными Ettan ПГЛП протокол был выполнен. Два идентичных образцов из CHO-K1 клеток, выращенных в той же колбе были помечены параллельно с двух различных протоколов, соответственно (рис. 1). На поверхности клеток Cy5 помечены образец работать на том же гель как Cy3 помечены Клеточный лизат. Зеленые пятна (Cy3) на гель (рис. 3А) представляют собой белки помечены использованием стандартных ПГЛП Ettan процедура, с помощью мембранной фракционирования. Эти пятна, предположительно, в том числе мембранных белков на поверхности клеток белков, а также белков из мембран внутри клетки (ER, Гольджи, митохондрии и ядра). Стандартный Ettan ПГЛП маркировки процедуру следует шаг фракционирования мембранных был выбран для сравнения, так как она должна дать наибольшую вероятность обнаружения низкого обильные белки клеточной поверхности. Красные пятна (Су 5) на гель (рис. 3А) находятся на поверхности клеток специфических белков помечены использованием новой ячейки поверхностного белка маркировки протокола, которые не видны с стандартную процедуру маркировки (зеленые пятна). Кроме того, желтые пятна представляют перекрытия белков, которые происходят в обеих выборках с использованием либо процедуры (рис. 3А). Еще одно полезное применение будет объединить обе маркировки протоколов отличить белки на поверхности клетки от тех, на внутриклеточные мембраны. Кроме того, информация об относительных изменениях в клеточной поверхности / мембранный белок уровней после различных раздражителей может последовать с использованием как маркировка методов одновременно.

Рис 3.

() 2-D геле образы СНО-К1 Cy5 поверхности клетки помечены образца (красные пятна, см. Протокол 1, рис 1) и мембраны фракционированного Cy3 образца (зеленого пятна, см. протокол 2, рис 1), помеченные в соответствии с стандартный Ettan ПГЛП протокола выполняются в той же 2-D геле. (B) DeCyder 2-D Дифференциальная программное обеспечение для анализа мнений 2-D геле показывает на поверхности клеток меченых белков не видно использованием стандартных Ettan ПГЛП протокола.

Идентификация белков клеточной поверхности,

Так как место картина очень отличается от поверхности клетки помечены образца и общего белка меченых образцов, необходимо было включить поверхности клетки помечены шип чтобы соответствие и идентификации клеточной поверхности пятна на карте место препаративной. Все белки клеточной поверхности, были собраны. Белков клеточной поверхности, может быть трудно определить из-за их низкой численности. Фактическое количество белка в некоторых местах может быть недостаточно для идентификации, так как белки клеточной поверхности, визуально обогащенный и физически не обогащенный с помощью этого протокола. Для облегчения успешной идентификации низкого обильные белки клеточной поверхности, препаративные количества общего белка может быть обогащен для мембранных белков перед нанесением на 2-D электрофореза. В этих клетках СНО, внутриклеточных мембранных белков и белков клеточной поверхности, составляют примерно 20% от общего белка в клетках. Для этого типа клеток, количества белка в местах потенциально может быть увеличена на коэффициент 5 на обогащение мембранных белков. Кроме того, использование узких градиент рН интервалом IPG полосы позволит применение больших количеств белка. В данном исследовании мы использовали только 600 мкг общего белка, без обогащения для мембранных белков, и широкой полосой IPG диапазона. Мы все еще в состоянии идентифицировать большое количество белков клеточной поверхности, из которых 82% были ранее известный как мембранные белки связаны.

Мультиплексирование

Чтобы проверить белок клеточной поверхности маркировки протокола в эксперименте Ettan ПГЛП использования всех трех красителей ^6, серии образцов сыворотки из обедненного клетки СНО были собраны и белков клеточной поверхности, помечены в различные моменты времени (табл. 1). Образцы были разделены на 2-D электрофореза. Подготовка внутреннего стандарта для ПГЛП эксперимент клеточной поверхности является прямым. В этом случае, Су 2 поверхности клетки помечены образцов (от всех временных точках) были объединены и использоваться в качестве внутреннего стандарта применительно к каждой 2-D геле. Все три CyDye ПГЛП Fluor минимальным красителей меченых белков клеточной поверхности, аналогично (данные не приведены). Изменения в выражении во время сывороточного голодания для многих белков клеточной поверхности, были обнаружены с помощью DeCyder 2-D программное обеспечение (рис. 4).

Рис 4.

Изменение выражения из двух клеточных поверхностных белков при голодании СНО-К1 клетки. Пятно карты были проанализированы с использованием DeCyder 2-D Дифференциальный анализ программного обеспечения.

Выводы

Новые Ettan ПГЛП протокол для сотовых маркировки поверхности белка происходит быстро, просто усебе и весьма специфичны для маркировки белков клеточной поверхности. Многие белки клетки романа поверхности обнаруживается только при использовании на поверхности клеток белков маркировки протокола. Более 80 новых поверхности клеток белков клеток СНО были обнаружены с помощью DeCyder 2-D Дифференциальный анализ программного обеспечения. Более 80% выявленных поверхности клетки помечены пятна мембранных белков, связанных с.

Мультиплексирование осуществляется с помощью трех CyDye ПГЛП Fluor минимальным красители, и в сочетании с DeCyder 2-D программного обеспечения, этот новый протокол является мощным инструментом для изучения белков клеточной поверхности, со всеми преимуществами, полученные с 2-D технологии ПГЛП.

Materials

Name	Type	Company	Catalog Number	Comments
CyDye DIGE Kit, 2 nmol	Reagent	GE Healthcare	28-9345-30
2-D Quant Kit	Reagent	GE Healthcare	80-6484-51
IPG Buffer pH 3-11NL	Reagent	GE Healthcare	17-6004-40
Immobiline DryStrip pH 3-11NL, 24 cm	Reagent	GE Healthcare	17-6003-77
IPGbox	Tool	GE Healthcare	28-9334-65
IPGbox kit	Tool	GE Healthcare	28-9334-92
DeStreak Rehydration solution	Reagent	GE Healthcare	17-6003-19
Immobiline DryStrip Cover Fluid	Reagent	GE Healthcare	17-1335-01
Ettan IPGphor 3 IEF Unit	Instrument	GE Healthcare	11-0033-64
Ettan IPGphor Manifold	Instrument component	GE Healthcare	80-6498-38
Ettan DALTtwelve Gel Caster	Tool	GE Healthcare	80-6467-22
Ettan DALTtwelve Separation Unit and Power Supply/Control Unit	Instrument	GE Healthcare	80-6466-46	230 V unit: 80-6466-27
Typhoon 9410 Variable Mode Imager	Instrument	GE Healthcare	63-0055-81
Ettan Spot Picker	Instrument	GE Healthcare	18-1145-28
Ettan Digester	Instrument	GE Healthcare	18-1142-68
Ettan Spotter	Instrument	GE Healthcare	18-1142-67
Ettan MALDI-TOF	Instrument	GE Healthcare	18-1142-33
DeCyder 2-D Differential Analysis Software	Other	GE Healthcare	28-4012-01
ImageQuant Analysis Software	Other	GE Healthcare	28-9236-62
Urea	Reagent	GE Healthcare	17-1319-01
CHAPS	Reagent	GE Healthcare	17-1314-01
PlusOne Dithiothreitol (DTT)	Reagent	GE Healthcare	17-1318-01
Bromophenol Blue	Reagent	GE Healthcare	17-1329-01
Tris	Reagent	GE Healthcare	17-1321-01
Sodium Dodecylsulfate (SDS)	Reagent	GE Healthcare	17-1313-01
PlusOne Glycerol 87%	Reagent	GE Healthcare	17-1325-01
PlusOne ReadySol IEF 40% T, 3% C	Reagent	GE Healthcare	17-1310-01
PlusOne TEMED	Reagent	GE Healthcare	17-1312-01
PlusOne Ammonium Persulfate	Reagent	GE Healthcare	17-1311-01
PlusOne Glycine	Reagent	GE Healthcare	17-1323-01
2-D Sample Prep for membrane proteins	Reagent	Pierce, Thermo Scientific	89864
Streptomycin sulphate	Reagent	Invitrogen	15140-122