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Coloration de Gram de bactéries provenant de Sources environnementales
 

Coloration de Gram de bactéries provenant de Sources environnementales

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Coloration de Gram permet une visualisation rapide de la morphologie bactérienne et large cellulaire distinction parmi une large gamme d’échantillons environnementaux. Pour souiller des bactéries, un frottis uniform est appliqué sur un côté de verre et laisser sécher. Après la chaleur-fixation le frottis, violet de gentiane est appliqué.

Un agent de décoloration rince away le violet de gentiane de cellules Gram négatifs, mais pas de Gram positifs cellules. Un deuxième colorant, généralement la safranine, est employé comme une tache de fond pour visualiser les cellules Gram négatifs. Une fois colorés, les cellules peuvent être évalués pour la morphologie cellulaire, taille et disposition, tels que des chaînes ou des grappes.

Cette vidéo vous montrera comment préparer un échantillon environnemental, isoler l’espèce bactérienne qui s’y trouve et effectuer une coloration de Gram sur les colonies isolées

Coloration de Gram permet de catégorisation de la plupart des bactéries en deux grandes classes structurales : bactéries Gram-positives et Gram-négatives. Alors que les deux classes ont une membrane de plasma phospholipides sous-jacente, la structure de la paroi cellulaire varie considérablement. La paroi cellulaire Gram positive est principalement composée d’une épaisse couche de peptidoglycane, qui est un polymère constitué de sucres et acides aminés. Parois des cellules Gram négatifs ont un amincissement de la couche de peptidoglycane, pris en sandwich entre une deuxième membrane lipidique. Cette membrane externe contient généralement des lipopolysaccharides.

Le violet de gentiane chargées positivement se lie faiblement à la paroi cellulaire bactérienne charge négative. Iode de Gram forme un complexe avec le colorant violet de gentiane, fixant ainsi dans la paroi cellulaire insoluble.

Durant l’étape décoloration, le peptidoglycane dans les cellules Gram positifs est déshydraté, faisant du contrat et de piéger les complexes de violet de gentiane-iode. Dans les cellules Gram-négatifs, l’agent de décoloration compromet la membrane externe, augmentant sa porosité. Cela permet les complexes de violet de gentiane-iode à être emportés.

Maintenant que vous comprenez les principes qui sous-tendent les bactéries du sol coloration Gram, nous allons voir le processus effectué sur des bactéries du sol en laboratoire.

Après avoir recueilli un échantillon de sol dans le domaine, mettre en laboratoire pour analyse. Affiner l’échantillon avec un tamis et peser 10 g de sol tamisé en utilisant une balance analytique.

Diluer l’échantillon dans 95 mL d’une solution saline tamponnée au phosphate et vortex pour mélanger. Effectuer des dilutions supplémentaires de 1 à 10, Vortex entre chaque dilution. Transfert des aliquotes d’au moins 3 dilutions successives, sur des plaques d’agarose nutritif faible répétées.

Après stérilisation éthanol-flamme et en appuyant sur le support de refroidissement d’une tige de verre courbé, étaler l’échantillon sur la surface des plaques. Incuber les plaques à température ambiante. Après incubation pendant 3 à 5 jours, sélectionnez la dilution la plus élevée avec des colonies isolées de 30 à 300. Avec une boucle d’inoculation stérile, sélectionner les colonies d’intérêt pour l’isolation.

Ensemencer la colonie sur une section d’une plaque de frais. Stérilisation de la boucle entre les stries, faire stries successifs en forme de zig-zag sur chaque section de la plaque permettant l’isolation ultérieure des colonies individuelles discrètes. Incuber les boîtes pendant 1 à 2 jours à température ambiante.

Pour commencer la préparation des frottis bactériennes, attacher un clip à une lame de verre préalablement nettoyé pour la facilité de manipulation. Pour chaque frottis bactérienne, nettoyer et flamme-stériliser une boucle d’inoculation. Placer 2 anses d’eau distillée stérile vers le centre de la diapositive.

Après la stérilisation de la boucle à nouveau, prélever une petite quantité de la culture d’une colonie isolée et mélanger avec l’eau sur la diapositive. Il est important de refroidir la boucle avant de toucher la culture en tapant sur une portion non inoculée de gélose plusieurs fois. Le frottis doit ressembler à lait dilué. Laisser la lame sécher à température ambiante. Après séchage, chaleur fixer le frottis en faisant passer rapidement dans une flamme.

Une fois sec, Pipeter cristal violet sur le frottis et laisser reposer pour 2-3 min. rincer soigneusement la lame avec de l’eau distillée en visant l’écoulement direct vers le haut de la glissoire, laissant l’eau s’écouler doucement vers le bas. Ne pas diriger le débit d’eau directement sur le frottis.

Colorer avec de l’iode de Gram. Après 2 min, rincer doucement à l’eau distillée. Décolorer la lame avec l’éthanol à 95 % jusqu'à ce que la tache se lave n’est plus loin. Rincer immédiatement avec de l’eau distillée. Vous limiterez ainsi les décoloration excessive le frottis.

Ajouter safranine comme une Counter-tache pour le frottis pendant 30 s. Cela tachera les cellules Gram-négatifs présents. Doucement, rincer à l’eau distillée et éponger avec du papier absorbant. Observer la diapositive qui en résulte avec un microscope. Utilisez d’abord un objectif de faible puissance à faire les ajustement grossier et rechercher une portion idéale d’un frottis avant de passer aux champ-de-vues plus petits des grossissements.

Après la nouvelle imagerie et en ajustant le frottis avec un objectif de puissance moyenne, ajoutez huile d’immersion directement sur le frottis. L’huile est nécessaire pour des objectifs de haute puissance qui offrent les meilleures photographies au microscope. Bactéries à Gram positif apparaîtront bleu ou violet en couleur, alors que des cellules Gram négatifs sera rouges ou rose. En plus de la structure de la paroi cellulaire, forme et la disposition ont été dégagés des résultante des micrographies.

La capacité de Gram coloration afin d’étudier qualitativement les bactéries est importante à un large éventail de domaines scientifiques.

Sol est l’une des sources environnementales dont les bactéries peuvent être isolées et analysés. Pour l’eau potable, la préparation de l’échantillon doit être modifiée. Échantillons d’eau du robinet peuvent être tirés d’un robinet et ensemencés sur milieux de culture qui facilite la croissance des colonies de bactéries diverses, hétérotrophes. Placage sur un support comme R2A, le processus est presque identique à celle du sol.

Pour certaines techniques d’identification bactérienne, les paramètres dépendent du type de la paroi cellulaire des bactéries d’intérêt. Dans cet exemple, le sang du patient septique a été testé et s’est avéré pour être héberger des bactéries Gram-positives.

Avec cette information, sondes d’acide nucléique peptidique spécifique à l’espèce ont été choisis qui crée une liaison avec ARNr des cellules. Ces sondes étaient liés à des colorants fluorescents qui ont été utilisés pour identifier les espèces présentes.

En raison des différences fondamentales dans la structure cellulaire de bactéries Gram-positive et - négative, bactéries ont des réponses uniques à d’autres composés en plus du violet de gentiane. Cette expérience a cherché à isoler le Clostridium difficile, une bactérie Gram positive, des échantillons de matières fécales. Cyclosérine, qui inhibe la croissance des cellules Gram-négatifs, a été ajouté à la gélose. Les cellules Gram-positives qui poussaient sur la plaque a de plus étaient isolé grâce aux autres méthodes.

Vous avez juste regardé introduction de JoVE à coloration de Gram pour les études environnementales. Vous devez maintenant comprendre les avantages du processus et la façon d’effectuer la technique et utiliser les résultats. Merci de regarder !

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