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Gramfärbung von Bakterien aus Umweltquellen

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Gramfärbung ermöglicht eine schnelle Visualisierung von bakteriellen Morphologie und breiten zellulare Unterscheidung aus einer breiten Palette von Umweltproben. Um Bakterien zu färben, ist ein einheitliche Abstrich auf eine Glasseite und trocknen gelassen. Nach der Hitze-Fixierung der Abstrich, wird Kristallviolett angewendet.

Ein Aufhellung Agent spült weg Kristallviolett von Gram-negativen Zellen, aber nicht Gram-positiven Zellen. Ein zweiten Farbstoff, in der Regel Safranin dient als ein Hintergrund-Fleck, um die Gram-negativen Zellen zu visualisieren. Sobald gebeizt, können die Zellen für Zellmorphologie, Größe und Anordnung, wie Ketten oder Cluster beurteilt werden.

Dieses Video demonstriert, wie eine ökologische Probe isolieren vorbereiten, die der Bakterienarten darin gefunden, die und führen Sie eine Gram-Färbung auf die isolierte Kolonien

Für die Kategorisierung von den meisten Bakterien in zwei große strukturelle Klassen ermöglicht Gramfärbung: grampositive und gramnegative. Während beide Klassen eine zugrunde liegende Plasmamembran Phospholipid haben, unterschiedlich die Struktur der Zellwand. Der Gram-positiven Zellwand besteht in erster Linie aus einer dicken Schicht von Peptidoglycan, ist ein Polymer, das aus Zucker und Aminosäuren besteht. Gramnegativen Zellwände haben eine dünnere Schicht von Peptidoglycan, eingeklemmt zwischen eine zweite Lipidmembran. Diese äußere Membran enthält in der Regel Lipopolysacchariden.

Die positiv geladenen Kristallviolett bindet schwach an negativ geladenen bakteriellen Zellwand. Gram Jod bildet einen unlöslichen Komplex mit Kristallviolett-Farbstoff, damit in der Zellwand Befestigung.

Während der Aufhellung Schritt ist der Peptidoglycane in den Gram-positiven Zellen entwässert, wodurch es bis zum Vertragsabschluss und fangen die Kristallviolett-Jod-komplexen. In Gram-negativen Zellen beeinträchtigt die Aufhellung Agent die äußere Membran Erhöhung seiner Porosität. Dies ermöglicht die Kristallviolett-Jod-komplexen weggespült werden.

Nun, da Sie die Prinzipien hinter Gram Färbung Bodenbakterien zu verstehen, sehen wir den Prozess auf Bodenbakterien im Labor durchgeführt.

Nach dem Sammeln einer Bodenprobe im Feld, bringt es in das Labor zur Analyse. Verfeinern Sie die Probe mit einem Sieb, und wiegen Sie 10 g des gesiebten Bodens mit einer Analysenwaage.

Verdünnen der Probenmaterials in 95 mL Phosphat-gepufferte Kochsalzlösung und Vortex mischen. Führen Sie weitere 1 bis 10 Verdünnungen, Bereich zwischen jeder Verdünnung. Aliquote mindestens 3 aufeinander folgende Verdünnungen auf replizieren niedrigen Nährstoff Agarose Teller zu übertragen.

Anschluss an Ethanol-Flamme Sterilisation und Kühlung von einem gebogenen Glasstab durch Tippen auf die Medien, verbreitet die Probe über die Oberfläche der Platten. Inkubieren Sie die Platten bei Raumtemperatur. Wählen Sie nach Inkubation für 3 bis 5 Tage die höchste Verdünnung mit diskreten Kolonien von 30 bis 300. Wählen Sie mit einer sterilen Impfkeimen Schleife Kolonien von Interesse für die Isolierung.

Streifen der Kolonie auf einem Abschnitt von einem frischen Teller. Sterilisieren die Schleife zwischen Schlieren, aufeinanderfolgenden Streifen machen Sie in einem Zick-Zack-Muster auf jedem Abschnitt der Platte, um nachträgliche Isolierung von diskreten einzelnen Kolonien zu ermöglichen. Inkubieren Sie die Platten für 1 bis 2 Tage bei Raumtemperatur.

Zur Vorbereitung der bakteriellen Abstrich zu beginnen, legen Sie einen Clip auf einem vorgereinigten Objektträger zur leichteren Handhabung. Für jede bakterieller Abstrich reinigen und eine Impfkeimen Schleife Flamme zu sterilisieren. Legen Sie 2 Loopfuls von sterilem destilliertem Wasser auf die Mitte der Folie.

Nach der Sterilisierung der Schleife wieder, eine kleine Menge der Kultur aus einem isolierten Kolonie zu entfernen, und mischen mit dem Wasser auf der Folie. Es ist wichtig, die Schleife abkühlen, bevor Sie die Kultur durch Tippen auf eine nicht inokulierten Teil des Nährbodens mehrmals berühren. Der Abstrich sollte verdünnte Milch ähneln. Lassen Sie die Folie trocken bei Raumtemperatur. Nach dem Trocknen Hitze fixieren den Abstrich indem man es schnell durch eine Flamme.

Nach dem Trocknen, pipette Kristallviolett auf dem Abstrich, und lassen Sie sich für ca. 2-3 min. sorgfältig spülen Sie die Folie mit destilliertem Wasser mit dem Ziel, des direkten Fluss in Richtung zur Oberseite der Folie, so dass das Wasser sanft nach unten zu fließen. Richten Sie den Wasserfluss direkt auf den Abstrich nicht.

Decken Sie die Folie mit Gram Jod. Spülen Sie nach 2 min sanft mit destilliertem Wasser ab. Die Folie mit 95 % igem Ethanol Bleichmittel, bis der Fleck nicht mehr wäscht. Sofort mit destilliertem Wasser abspülen. Dies schränkt über Entfärbung der Abstrich.

Füge Safranin als einen Counter Fleck dem Abstrich für 30 s. Dies färbt alle Gram-negativen Zellen vorhanden. Sanft mit destilliertem Wasser abspülen und mit Küchenpapier trocken tupfen. Die daraus resultierende Folie mit einem Mikroskop zu beobachten. Verwenden Sie ein low-Power-Ziel zuerst grobe Anpassungen und finden eine ideale Portion des Abstrichs bevor ich auf die kleineren Bereich der Ansichten von den höheren Vergrößerungen.

Fügen Sie nach weiteren Bildgebung und Anpassung der Abstrich mit mittlerer Leistung Zielsetzung Immersionsöl direkt den Abstrich hinzu. Das Öl ist für Hochleistungs-Ziele benötigt, die die besten Mikrographen bieten wird. Gram-positiven Bakterien erscheinen blau oder violett in der Farbe, während Gram-negativen Zellen rot werden oder rosa. Neben der Zellwandstruktur sind Form und Anordnung von der daraus resultierenden Mikrographen aufgeklärt.

Die Fähigkeit der Gram Färbung um qualitativ Bakterien zu studieren ist wichtig, den unterschiedlichsten wissenschaftlichen Bereichen.

Boden gehört zu den ökologischen Quellen aus denen Bakterien isoliert und analysiert werden können. Für Trinkwasser muss Probenvorbereitung geändert werden. Proben von Leitungswasser können gezeichnet aus einem Hahn, und vergoldet auf Wachstumsmedien, die das Wachstum von vielfältigen, heterotrophen Bakterienkolonien erleichtert. Bei der Beschichtung auf ein Medium wie R2A ist der Prozess fast identisch mit der Boden-Verfahren.

Die Parameter sind für bestimmte bakterielle Identifizierungstechniken abhängig die Zellwand der Bakterien von Interesse. In diesem Beispiel einen septischen Patienten Blut wurde getestet und erwies sich als Gram-positiven Bakterien beherbergen.

Mit diesen Informationen wurden artspezifische Peptid-Nukleinsäure Sonden gewählt, um die Zellen rRNA binden würde. Diese Sonden wurden an Fluoreszenzfarbstoffen gebunden, die verwendet wurden, um die Artenvielfalt zu identifizieren.

Bakterien haben aufgrund der grundlegenden Unterschiede in gram-positive und negative - Zellstruktur eindeutige Antworten auf andere Verbindungen neben Kristallviolett. Dieses Experiment versucht, Clostridium Difficile, ein grampositives Bakterium aus Stuhlproben zu isolieren. Cycloserin, die das Wachstum von Gram-negativen Zellen hemmt, wurde die Agarplatte hinzugefügt. Die Gram-positiven Zellen, die auf dem Teller wuchs wurden weitere über andere Methoden isoliert.

Sie habe nur Jupiters Einführung in die Gramfärbung für Umweltstudien beobachtet. Sie sollten jetzt die Vorteile des Prozesses und Gewusst wie: führen Sie die Technik und die Ergebnisse zu nutzen verstehen. Danke fürs Zuschauen!

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