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Tinción de Gram de la Bacteria de fuentes ambientales
 

Tinción de Gram de la Bacteria de fuentes ambientales

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Tinción de Gram permite la rápida visualización de la morfología bacteriana y amplia distinción celular de una amplia gama de muestras ambientales. Para teñir las bacterias, un borrón de transferencia uniforme se aplica a un lado y deja secar. Después de calor-fijar el frotis, se aplica el cristal violeta.

Un agente decolorante, enjuaga el cristal violeta de células Gram-negativas, pero las células Gram positivas no. Un segundo colorante, generalmente safranina, se utiliza como una mancha de fondo para visualizar las células Gram-negativas. Una vez teñido, las células pueden ser evaluadas para la morfología de la célula, tamaño y arreglo, como cadenas o racimos.

Este video demuestra cómo preparar una muestra ambiental, aislar las especies bacterianas encontraron en ella y realizan una tinción de Gram de las colonias aisladas

Tinción de Gram permite la categorización de la mayoría de las bacterias en dos grandes clases estructurales: bacterias grampositivas y gramnegativas. Mientras que ambas clases tienen una membrana fosfolípidos subyacente, la estructura de la pared celular varía enormemente. Gram-positivas la pared celular se compone principalmente de una gruesa capa de peptidoglicano, que es un polímero que consiste de azúcares y aminoácidos. Paredes celulares Gram-negativas tienen una capa más delgada de peptidoglicano, intercalada entre una segunda membrana lipídica. Normalmente, esta membrana externa contiene lipopolisacáridos.

El violeta de cristal cargado positivamente se une débilmente a la pared celular bacteriana cargada negativamente. Yodo de Gram forma un complejo con el colorante cristal violeta, tal modo de fijación en la pared celular insoluble.

Durante el paso de decolorante, se deshidrata el peptidoglicano en las células Gram positivas, causando que se contrato y atrapar a los complejos de cristal violeta-yodo. En las células Gram-negativas, el agente decolorante compromete la membrana externa, aumentando su porosidad. Esto permite que los complejos de cristal violeta-yodo ser arrastrados.

Ahora que usted entiende los principios detrás de Gram Tinción bacterias del suelo, vamos a ver la labor de las bacterias del suelo en el laboratorio.

Después de recoger una muestra de suelo en el campo, ponerla en el laboratorio de análisis. Refinar la muestra con un tamiz y pesar 10 g de suelo tamizado con una balanza analítica.

Diluir la muestra en 95 mL de solución salina con tampón fosfato y agitar para mezclar. Realizar más diluciones de 1 a 10, Vortex entre cada dilución. Transferir alícuotas de diluciones sucesivas al menos 3, sobre placas de agarosa nutrientes bajos repetidos.

Después de esterilización llama etanol y enfriamiento de una varilla de vidrio doblada dando golpecitos sobre los medios de comunicación, difundir la muestra sobre la superficie de las placas. Incubar las placas a temperatura ambiente. Después de incubar durante 3 a 5 días, seleccionar la dilución mayor con 30 a 300 colonias discretas. Con un asa de inoculación estéril, seleccionar las colonias de interés para el aislamiento.

La Colonia en una sección de una placa fresca de la raya. El lazo entre las rayas de la esterilización, hacer rayas sucesivas en un patrón de zig-zag en cada sección de la placa para permitir el posterior aislamiento de colonias individuales discretas. Incubar las placas durante 1 a 2 días a temperatura ambiente.

Para iniciar la preparación de frotis bacteriano, coloque un clip en un portaobjeto previamente limpiado para facilidad de manejo. Para cada frotis bacteriano, limpiar y llama-esterilizar un asa de inoculación. Coloque 2 loopfuls de agua destilada estéril en el centro de la diapositiva.

Después de esterilizar el asa, extraer una pequeña cantidad de cultivo de una colonia aislada y mezclar con el agua en el portaobjetos. Es importante enfriar el asa antes de tocar la cultura golpeando una parte sin inocular agar varias veces. El borrón de transferencia debería parecerse a la leche diluida. Permita que el portaobjetos se seque a temperatura ambiente. Después de secar, calor fijar el frotis pasándolo rápidamente a través de una llama.

Una vez seco, pipeta de cristal violeta en el frotis y dejar reposar por 2-3 minutos enjuagar cuidadosamente el portaobjetos con agua destilada por dirigir el chorro directo hacia la parte superior de la diapositiva, permitiendo que el agua fluya suavemente hacia abajo. No dirija el flujo de agua directamente en el frotis.

Cubrir el portaobjetos con yodo de Gram. Después de 2 minutos, enjuague suavemente con agua destilada. Decolorar la diapositiva con etanol al 95% hasta que la mancha ya no se remueve. Enjuague inmediatamente con agua destilada. Esto limitará demasiado decolorar el frotis.

Agregar safranina como colorante contra al frotis para 30 s. Esto mancha las células gramnegativas presentes. Suavemente, enjuague con agua destilada y seque con papel absorbente. Observe la diapositiva resultante con un microscopio. Utilice un objetivo de baja potencia primero hacer ajustes gruesos y encontrar una porción ideal del frotis antes de pasar a las más pequeño campo de vistas de los aumentos más altos.

Después de la proyección de imagen adicional y ajustar el frotis con un objetivo de potencia media, agregue aceite de inmersión directamente en el frotis. El aceite es necesario para objetivos de alta potencia que proporcionarán el mejores micrografías. Bacterias Gram-positivas aparecerán azul o púrpura en color, mientras que las células Gram negativas será rojo o rosa. Además de estructura de la pared celular, forma y disposición están aclados de las imágenes resultantes.

La capacidad de tinción para el estudio cualitativo bacterias de Gram es importante para una amplia gama de campos científicos.

Suelo es una de las fuentes ambientales de que bacterias pueden ser aisladas y analizadas. Para el agua potable, se debe modificar la preparación de la muestra. Muestras de agua del grifo pueden ser dibujadas de un grifo y plateadas en medios del crecimiento que facilita el crecimiento de colonias bacterianas diversas, heterótrofos. Sobre chapado en un medio como R2A, el proceso es casi idéntico al procedimiento de suelo.

Para ciertas técnicas de identificación bacteriana, los parámetros son dependientes en el tipo de pared celular de las bacterias de interés. En este ejemplo, la sangre de un paciente séptico fue probada y fue encontrada para ser albergar bacterias Gram-positivas.

Con esta información, sondas de ácidos nucleicos péptidos específicos fueron elegidas que se unen a rRNA las células. Estas puntas de prueba fueron obligados a tintes fluorescentes que fueron utilizados para identificar las especies presentes.

Debido a las diferencias fundamentales de estructura celular Gram-positiva y - negativo, bacterias tienen respuestas únicas a otros compuestos además de violeta cristal. Este experimento buscaba aislar Clostridium difficile, una bacteria gram-positiva, de muestras de heces. Cicloserina, que inhibe el crecimiento de las células Gram negativas, se añadió a la placa de agar. Las células Gram positivas que crecieron en la placa fueron más aisladas mediante otros métodos.

Sólo ha visto introducción de JoVE a tinción de Gram para estudios ambientales. Ahora debe comprender los beneficios del proceso y cómo realizar la técnica y utilizar los resultados. ¡Gracias por ver!

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