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Estrazione di biomarcatori dai sedimenti - estrazione accelerata con solvente
 
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Estrazione di biomarcatori dai sedimenti - estrazione accelerata con solvente

Overview

Fonte: Laboratorio di Jeff Salacup - Università del Massachusetts Amherst

La distribuzione di un gruppo di biomarcatori organici chiamati glicerolo-dialchilglicerolo-tetraeteri (GDFT), prodotti da una serie di archaea e batteri, sono stati trovati nei sedimenti moderni per cambiare in modo prevedibile in risposta alla temperatura dell'aria o dell'acqua1,2. Pertanto, la distribuzione di questi biomarcatori in una sequenza di sedimenti di età nota può essere utilizzata per ricostruire l'evoluzione della temperatura dell'aria e/o dell'acqua su scale temporali da decadali a millenarie (Figura 1). La produzione di lunghe registrazioni ad alta risoluzione dei climi passati, chiamate paleoclimatologia, dipende dalla rapida analisi di centinaia, forse migliaia di campioni. Le tecniche di estrazione più vecchie, come la sonicazione o Soxhlet, sono troppo lente. Tuttavia, la nuova tecnica di estrazione con solvente accelerato è stata progettata tenendo presente l'efficienza.

Figure 1
Figura 1. Un esempio di un record paleoclimatiche che mostra cambiamenti nella temperatura superficiale del mare (SST) nel Mar Mediterraneo orientale negli ultimi ~ 27.000 anni3. Questo record comprende ~ 115 campioni e si basa sul proxy TEX86 SST isoprenoidale basato su GDGT.

Principles

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L'estrazione con solvente accelerato è un metodo di estrazione registrato (Thermo Scientific Dionex) che utilizza alte temperature (~ 100 ° C) e pressioni (~ 1.200 psi) per aumentare la cinetica del processo di estrazione. L'estrattore, chiamato estrattore di solvente accelerato, o ASE (Figura 2), può contenere fino a 24 singoli campioni. Una volta che l'ASE è caricato e impostato per l'esecuzione, è completamente automatizzato. L'ASE consente il controllo elettronico dell'intero processo di estrazione: temperatura di estrazione, pressione, volume del solvente, miscela di solventi, durata, risciacquo e ripetizione sono tutti regolabili da campione a campione. La maggior parte dei laboratori di geochimica organica ora utilizza l'ASE come metodo standard di estrazione con solvente.

Figure 2
Figura 2. Un estrattore di solvente accelerato (ASE).

L'estrazione accelerata con solvente è una tecnica veloce, efficiente e ad alto rendimento utilizzata per separare i biomarcatori organici da un gran numero di campioni di sedimenti geologici.

Tradizionalmente, vengono utilizzati metodi di estrazione come la sonicazione o Soxhlet, tuttavia, lo svantaggio di questi protocolli è che sono troppo lenti per elaborare abbastanza materiale per una ricostruzione paleoclimatica dettagliata. Una tecnica più recente, l'estrazione accelerata con solvente, o metodo ASE, è stata sviluppata tenendo conto dell'efficienza e dell'elevata produttività.

Il metodo ASE utilizza una combinazione di alte temperature e alta pressione per estrarre i campioni e può eseguire più campioni in un'unica preparazione relativamente veloce.

Questo video è il terzo di una serie che descrive in dettaglio come estrarre i biomarcatori dai sedimenti. Coprirà la procedura e fornirà informazioni sui meriti dell'ASE rispetto alla sonicazione o all'estrazione di Soxhlet.

Nell'estrazione accelerata con solvente, i campioni vengono caricati in celle di acciaio che vengono poi caricate su una giostra. Anche i flaconcini di raccolta per ciascuna cella campione vengono caricati su un carosello separato. Lo strumento carica una cella campione in un forno interno. Il solvente viene pompato da una bottiglia di solvente attraverso una serie di valvole fino a raggiungere una pressione sufficiente.

Questa pressione viene mantenuta per un periodo di tempo dettato dal campione e dall'analita. Quindi, il solvente viene lavato dalla cella del campione attraverso una linea di acciaio nel flaconcino di raccolta corrispondente. Il processo può essere ripetuto più volte. La temperatura, la pressione e la durata possono essere personalizzate per il campione.

L'alta temperatura utilizzata aumenta la cinetica dell'estrazione mentre l'alta pressione impedisce al solvente di volare. La fiala di raccolta ora contiene un estratto lipidico totale e ciò che rimane nella cellula campione è chiamato residuo. Comprende materiale non organico e materiale organico che non è estraibile con solvente, chiamato kerogen.

Ora che abbiamo familiarità con i principi alla base dell'estrazione accelerata con solvente, diamo un'occhiata a come questo viene effettuato in laboratorio.

Dopo aver raccolto campioni di interesse; liofilizzare, omogeneizzare e decontaminare come dimostrato in un altro video di questa serie.

Una volta che tutti i campioni sono stati preparati, assemblare una cella per ciascuno da estrarre e una in più per uno spazio vuoto. Per fare ciò, avvitare un cappuccio terminale sul corpo della cella. Utilizzando pinzette risciacquate con solvente, posizionare un filtro in fibra di vetro bruciato sopra ciascuno di essi. Premere lentamente e delicatamente il filtro verso il basso con lo stantuffo.

Etichettare i corpi delle celle in numero per ogni campione ed etichettare lo spazio vuoto separatamente. Posizionare una teglia bruciata su una bilancia da laboratorio e tarare. Risciacquare una spatola con solvente, quindi utilizzarla per trasferire da 5 a 10 g di campione nella scatola di pesatura e registrare la massa.

Trasferire tutto il materiale nella scatola di pesatura nella cella corrispondente. Posizionare un altro filtro in fibra di vetro sopra e tamponare delicatamente fino a raggiungere la parte superiore del campione.

Aggiungere un disperdente, come terra diatomacea o sabbia, fino a quando non è quasi pieno, facendo attenzione a evitare di ottenere detriti nei fili del corpo cellulare. Chiudere la parte superiore della cella con un altro cappuccio terminale. Ripetere questi passaggi per ogni campione e lo spazio vuoto.

Etichettare ogni flaconcino di raccolta con il numero di una cella campione corrispondente o vuota e chiudere con un tappo del flaconcino. Posizionare ogni cella in uno slot numerato sul vassoio ASE superiore. Impostare i parametri per il metodo di estrazione utilizzando la tastiera dell'ASE per estrarre a 100 °C e 1.200 psi. Estrarre ogni campione 3 volte con una presa statica di 10 minuti e lavare il corpo cellulare con il 50% del suo volume totale tra le prese statiche.

Quindi, assicurarsi che il flacone di solvente contenga abbastanza per estrarre tutti i campioni. Risciacquare le linee dello strumento 3 volte prima di iniziare la corsa. Infine, premere start.

Rimuovere il flaconcino dall'ASE. Ora che i biomarcatori sono stati estratti, devono essere purificati prima dell'analisi.

L'estrazione con solvente accelerato è una tecnica versatile, che può essere utilizzata per una varietà di applicazioni, alcune delle quali sono esplorate qui.

L'estrazione accelerata con solvente può essere utilizzata anche su altri tipi di campioni, compresi gli alimenti. L'analisi dei residui per testare la contaminazione da pesticidi viene spesso effettuata in strutture normative e industriali per accertare la sicurezza e la qualità dei prodotti alimentari come frutta o verdura. L'ASE può essere utilizzato per estrarre pesticidi organoclorurati da campioni alimentari e determinare i tipi o i livelli di residui presenti nel prodotto. Queste informazioni possono quindi essere utilizzate per stabilire se i prodotti sono idonei al consumo umano o animale. Ad esempio, il dieldrin dovrebbe essere trovato entro 0-0,1 parti per milione sul cibo, a seconda del prodotto.

I componenti nutrizionali alimentari possono anche essere estratti utilizzando ASE. Ad esempio, prodotti come il cioccolato, che possono avere un alto contenuto di grassi gravimetrici, possono essere estratti. Utilizzando l'ASE con etere di petrolio come solvente, il grasso può essere separato dai campioni di cioccolato e sottoposto ad analisi quantitative per determinare una percentuale accurata di contenuto di grassi per quantità nota di cioccolato. Utilizzando queste informazioni, gli organismi di regolamentazione possono verificare le affermazioni fatte dai produttori di cioccolato o i produttori possono ottenere informazioni per creare etichette alimentari accurate.

Hai appena visto l'introduzione di JoVE all'estrazione di biomarcatori lipidici utilizzando l'estrazione accelerata con solvente o ASE. I metodi per ulteriori elaborazioni e analisi possono essere trovati nei video successivi.

Grazie per l'attenzione!

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Procedure

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1. Raccolta dei materiali necessari

  1. Estrarre campioni. I campioni (in questo caso, sedimenti) vengono congelati, liofilizzati, frantumati e omogeneizzati prima dell'estrazione ed estratti in gruppi per massimizzare l'efficienza.
  2. A seconda delle dimensioni del campione, utilizzare flaconcini di raccolta con volumi di 40 o 60 ml. Per questo esperimento vengono utilizzate fiale di vetro borosilicato (40 ml) e tappi sicuri con solvente. Bruciare flaconcini, pipette di vetro borosilicato e barattoli di pesatura a 550 °C per 6 ore prima di garantire la rimozione di possibili contaminanti organici.
  3. Il diclorometano (DCM) e il metanolo sono comuni nella maggior parte dei laboratori di geochimica organica. Usali singolarmente (metanolo prima, seguito da DCM) per risciacquare strumenti da laboratorio e bicchieri prima dell'uso. Una miscela di diclorometano a metanolo (MeOH; 9:1) viene utilizzata in molti laboratori per estrarre in modo efficiente biomarcatori con una vasta gamma di polarità. I solventi devono essere privi di contaminanti organici.
  4. Ottenere un estrattore di solvente accelerato da utilizzare per questo esperimento.

2. Preparazione delle cellule campione

  1. Assemblare una cella campione per ogni campione da estrarre, più uno vuoto.
    1. Per ogni cella, avvitare un cappuccio terminale su un'estremità del corpo della cella.
    2. Posizionare un filtro in fibra di vetro bruciato sopra ogni cella usando una pinzetta risciacquata con solvente. Quindi, premere delicatamente e lentamente il filtro nella cella utilizzando lo stantuffo del filtro.
    3. Etichettare i corpi cellulari per numero(ad esempio 1 - 22) per ciascun campione e scrivere "vuoto" sulla cella vuota.
    4. Riempire lo spazio vuoto con terra diatomacea (o sabbia) e chiudere con un secondo tappo terminale. Stringere a mano.

3. Preparazione dei campioni

  1. Posizionare una teglia bruciata sulla bilancia da laboratorio e quindi tarare.
  2. Risciacquare la spatola da laboratorio con solvente, quindi utilizzarla per trasferire una massa appropriata di campione nella scatola di pesatura e registrare la massa.
    1. La massa del campione varia a seconda del suo contenuto di materia organica. Il materiale magro relativamente organico (fango marino) può richiedere diversi grammi, mentre il materiale ricco di materia organica (tessuto fogliare) può richiedere molto meno.
  3. Trasferire tutto il materiale nella scatola di pesatura in una cella ASE preparata.
  4. Posizionare un altro filtro in fibra di vetro sulla parte superiore della cella, quindi premere lentamente e delicatamente verso il basso fino a raggiungere la parte superiore del campione utilizzando lo stantuffo del filtro.
  5. Aggiungere terra diatomee (o sabbia) alla cellula fino a quando non è quasi piena. Fare attenzione a rimuovere eventuali detriti dai fili del corpo cellulare.
  6. Chiudere la parte superiore della cella con un altro cappuccio terminale.
  7. Ripetere i passaggi 3.1 - 3.6 per ogni campione.

4. Preparazione delle fiale di raccolta

  1. Etichettare ogni flaconcino con il numero di una cella corrispondente(ad es. 1 - 22 o vuota) e tappo con tappo del flaconcino di raccolta ASE.

5. Estrazione

  1. Posizionare ogni cella campione in uno slot numerato sul vassoio ASE superiore.
  2. Posizionare il flaconcino di raccolta corrispondente nello stesso slot numerico sul vassoio ASE inferiore.
  3. Creare il metodo di estrazione utilizzando la tastiera dell'ASE. Estrarre a 100 °C e 1.200 psi. Estrarre ogni campione 3 volte con una presa statica di 10 minuti e lavare il corpo cellulare con il 50% del suo volume totale tra le prese statiche.
  4. Assicurarsi che il flacone di solvente contenga abbastanza solvente per estrarre tutti i campioni.
  5. Risciacquare l'ASE 3x prima di iniziare la corsa premendo il pulsante "risciacquo" sul pad di controllo ASE.
  6. Premere start.

L'estrazione accelerata con solvente è una tecnica veloce, efficiente e ad alto rendimento utilizzata per separare i biomarcatori organici da un gran numero di campioni di sedimenti geologici.

Tradizionalmente, vengono utilizzati metodi di estrazione come la sonicazione o Soxhlet, tuttavia, lo svantaggio di questi protocolli è che sono troppo lenti per elaborare abbastanza materiale per una ricostruzione paleoclimatica dettagliata. Una tecnica più recente, l'estrazione accelerata con solvente, o metodo ASE, è stata sviluppata tenendo conto dell'efficienza e dell'elevata produttività.

Il metodo ASE utilizza una combinazione di alte temperature e alta pressione per estrarre i campioni e può eseguire più campioni in un'unica preparazione relativamente veloce.

Questo video è il terzo di una serie che descrive in dettaglio come estrarre i biomarcatori dai sedimenti. Coprirà la procedura e fornirà informazioni sui meriti dell'ASE rispetto alla sonicazione o all'estrazione di Soxhlet.

Nell'estrazione accelerata con solvente, i campioni vengono caricati in celle di acciaio che vengono poi caricate su una giostra. Anche i flaconcini di raccolta per ciascuna cella campione vengono caricati su un carosello separato. Lo strumento carica una cella campione in un forno interno. Il solvente viene pompato da una bottiglia di solvente attraverso una serie di valvole fino a raggiungere una pressione sufficiente.

Questa pressione viene mantenuta per un periodo di tempo dettato dal campione e dall'analita. Quindi, il solvente viene lavato dalla cella del campione attraverso una linea di acciaio nel flaconcino di raccolta corrispondente. Il processo può essere ripetuto più volte. La temperatura, la pressione e la durata possono essere personalizzate per il campione.

L'alta temperatura utilizzata aumenta la cinetica dell'estrazione mentre l'alta pressione impedisce al solvente di volare. La fiala di raccolta ora contiene un estratto lipidico totale e ciò che rimane nella cellula campione è chiamato residuo. Comprende materiale non organico e materiale organico che non è estraibile con solvente, chiamato kerogen.

Ora che abbiamo familiarità con i principi alla base dell'estrazione accelerata con solvente, diamo un'occhiata a come questo viene effettuato in laboratorio.

Dopo aver raccolto campioni di interesse; liofilizzare, omogeneizzare e decontaminare come dimostrato in un altro video di questa serie.

Una volta che tutti i campioni sono stati preparati, assemblare una cella per ciascuno da estrarre e una in più per uno spazio vuoto. Per fare ciò, avvitare un cappuccio terminale sul corpo della cella. Utilizzando pinzette risciacquate con solvente, posizionare un filtro in fibra di vetro bruciato sopra ciascuno di essi. Premere lentamente e delicatamente il filtro verso il basso con lo stantuffo.

Etichettare i corpi delle celle in numero per ogni campione ed etichettare lo spazio vuoto separatamente. Posizionare una teglia bruciata su una bilancia da laboratorio e tarare. Risciacquare una spatola con solvente, quindi utilizzarla per trasferire da 5 a 10 g di campione nella scatola di pesatura e registrare la massa.

Trasferire tutto il materiale nella scatola di pesatura nella cella corrispondente. Posizionare un altro filtro in fibra di vetro sopra e tamponare delicatamente fino a raggiungere la parte superiore del campione.

Aggiungere un disperdente, come terra diatomacea o sabbia, fino a quando non è quasi pieno, facendo attenzione a evitare di ottenere detriti nei fili del corpo cellulare. Chiudere la parte superiore della cella con un altro cappuccio terminale. Ripetere questi passaggi per ogni campione e lo spazio vuoto.

Etichettare ogni flaconcino di raccolta con il numero di una cella campione corrispondente o vuota e chiudere con un tappo del flaconcino. Posizionare ogni cella in uno slot numerato sul vassoio ASE superiore. Impostare i parametri per il metodo di estrazione utilizzando la tastiera dell'ASE per estrarre a 100 °C e 1.200 psi. Estrarre ogni campione 3 volte con una presa statica di 10 minuti e lavare il corpo cellulare con il 50% del suo volume totale tra le prese statiche.

Quindi, assicurarsi che il flacone di solvente contenga abbastanza per estrarre tutti i campioni. Risciacquare le linee dello strumento 3 volte prima di iniziare la corsa. Infine, premere start.

Rimuovere il flaconcino dall'ASE. Ora che i biomarcatori sono stati estratti, devono essere purificati prima dell'analisi.

L'estrazione con solvente accelerato è una tecnica versatile, che può essere utilizzata per una varietà di applicazioni, alcune delle quali sono esplorate qui.

L'estrazione accelerata con solvente può essere utilizzata anche su altri tipi di campioni, compresi gli alimenti. L'analisi dei residui per testare la contaminazione da pesticidi viene spesso effettuata in strutture normative e industriali per accertare la sicurezza e la qualità dei prodotti alimentari come frutta o verdura. L'ASE può essere utilizzato per estrarre pesticidi organoclorurati da campioni alimentari e determinare i tipi o i livelli di residui presenti nel prodotto. Queste informazioni possono quindi essere utilizzate per stabilire se i prodotti sono idonei al consumo umano o animale. Ad esempio, il dieldrin dovrebbe essere trovato entro 0-0,1 parti per milione sul cibo, a seconda del prodotto.

I componenti nutrizionali alimentari possono anche essere estratti utilizzando ASE. Ad esempio, prodotti come il cioccolato, che possono avere un alto contenuto di grassi gravimetrici, possono essere estratti. Utilizzando l'ASE con etere di petrolio come solvente, il grasso può essere separato dai campioni di cioccolato e sottoposto ad analisi quantitative per determinare una percentuale accurata di contenuto di grassi per quantità nota di cioccolato. Utilizzando queste informazioni, gli organismi di regolamentazione possono verificare le affermazioni fatte dai produttori di cioccolato o i produttori possono ottenere informazioni per creare etichette alimentari accurate.

Hai appena visto l'introduzione di JoVE all'estrazione di biomarcatori lipidici utilizzando l'estrazione accelerata con solvente o ASE. I metodi per ulteriori elaborazioni e analisi possono essere trovati nei video successivi.

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Results

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Alla fine dell'estrazione, c'è un estratto lipidico totale (TLE) per ogni campione. Ogni fiala ora contiene la materia organica estraibile da un sedimento, un suolo o un tessuto vegetale. Questi TLE possono essere analizzati e i loro costituenti chimici identificati e quantificati.

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Applications and Summary

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I TLE dei campioni estratti contengono un ampio spettro di diversi composti organici, compresi i GDCT da utilizzare per ricostruire le temperature antiche. Glicerolo-dialchilglicerolo-tetraeteri sono una vasta suite di biomarcatori che mostrano sensibilità alle temperature di crescita. Esistono due gruppi di GDCT, ramificati e isoprenoidi, che differiscono nel carattere dei modelli ramificati sui gruppi alchilici principali (Figura 3). Nell'oceano, un gruppo cosmopolita di archaea, chiamato Thaumarchaeota, produce GDCT isoprenoidi4. I GDCT ramificati sono prodotti sulla terra nei terreni5,laghi e nei sedimentilacustri 6 da batteri non ancora identificati, probabilmente Acidobacteria7. Sia gli archaea che i batteri regolano il numero di rami metilici e strutture ad anello nel gruppo alchilico del nucleo in base alla temperatura di crescita e, poiché i GDCT sono stabili nei sedimenti per milioni di anni, vengono generate lunghe registrazioni ad alta risoluzione dei cambiamenti climatici utilizzandoli.

Il proxy di temperatura dell'acqua paleo TEX86 si basa sul rapporto di alcuni GDCT isoprenoidali, ciascuno contenente 86 atomi di carbonio nel suo gruppo alchilico centrale (Figura 3):

TEX86 = (GDGT-2 + GDGT-3 + GDGT-4') /
(GDGT-1 + GDGT-2 + GDGT-3 + GDGT-4')

La temperatura dell'acqua paleo viene quindi dedotta utilizzando una calibrazione, come l'equazione originale:

TEX86 = 0,015T + 0,28 (R2 = 0,92)

Proposto da Schouten et al. 1, dove T è paleotemperatura. Diverse altre calibrazioni regionali e locali sono state sviluppate per perfezionare ulteriormente il proxy per l'uso in grandi laghi o nei tropici, per esempio.

Figure 3
Figura 3. Strutture chimiche dei GDCT isoprenoidali e ramificati. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

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References

  1. Schouten, S. et al. Distributional variations in marine crenarchaeotal membrane lipids: a new tool for reconstructing ancient sea water temperatures?, Earth and Planetary Science Letters204(1-2), 265-274 (2002).
  2. Weijers, J. W. H. et al. Environmental controls on bacterial tetraether membrane lipid distribution in soils, Geochimica et Cosmochimica Acta71(3), 703-713 (2007).
  3. Castaneda, I. S. et al. Millennial-scale sea surface temperature changes in the eastern Mediterranean (Nile River Delta region) over the last 27,000 years, Paleoceanography, 25, 13 (2010).
  4. Damste, J. S. S. et al. Crenarchaeol: the characteristic core glycerol dibiphytanyl glycerol tetraether membrane lipid of cosmopolitan pelagic crenarchaeota, J Lipid Res, 43(10), 1641-1651 (2002).
  5. Hopmans, E. C. et al. A novel proxy for terrestrial organic matter in sediments based on branched and isoprenoid tetraether lipids, Earth and Planetary Science Letters224(1-2), 107-116 (2004).
  6. Tierney, J. E., Russell J. M. Distributions of branched GDGTs in a tropical lake system: Implications for lacustrine application of the MBT/CBT paleoproxy, Organic Geochemistry40(9), 1032-1036 (2009).
  7. Damste, J. S. S. et al. 13,16-Dimethyl Octacosanedioic Acid (iso-Diabolic Acid), a Common Membrane-Spanning Lipid of Acidobacteria Subdivisions 1 and 3, Appl Environ Microb, 77(12), 4147-4154 (2011).

Transcript

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