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Environmental Microbiology

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Mise en culture et en énumérant les bactéries provenant des échantillons de sol
 

Mise en culture et en énumérant les bactéries provenant des échantillons de sol

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Établir un compte précis des bactéries environnementales est essentielle pour évaluer la santé d’un écosystème de sol. Ceci peut être accompli en cultivant des colonies bactériennes avec des dilutions appropriées.

Les bactéries du sol sont une partie importante d’un écosystème sain sol, jouant un rôle dans la décomposition, fixatrices d’azote et cycles des éléments nutritifs. Sols superficiels sont un substrat organique et les particules inorganiques formant une matrice complexe entourant les pores qui se remplir d’air ou par eau. Ces conditions créent un écosystème idéal pour les bactéries, avec des sols de surface généralement contenant plus de 1 million de bactéries par gramme.

En raison de cette forte concentration de bactéries, la dilution est nécessaire avant l’ensemencement sur milieu de culture. Des dilutions successives peuvent réduire la concentration de l’échantillon de sol original à des niveaux suffisamment bas pour que les colonies individuelles à être cultivé sur des plaques de support, permettant le calcul des premiers comtes de bactéries dans l’échantillon de sol.

Cette vidéo illustre comment préparer des dilutions d’échantillons de sol, comment ces échantillons bactériens sur plaque et comment calculer sol bactérienne compte sur les plaques de dilution.

Les bactéries sont des organismes procaryotes simples, mais très diversifié en termes d’espèces et des écosystèmes. Actinomycètes sont un sous-ensemble des bactéries qui sont souvent considéré comme un groupe unique en raison de leur structure filamenteuse, où ils cultivent enfilées ensemble aux hyphes de forme.

En général, actinomycètes représentent 10 % de la population bactérienne dans le sol. Les bactéries et les actinomycètes sont abondants dans presque tous les milieux sur la terre, mais sont trouvent dans l’incomparable diversité et l’abondance dans le sol.

Les bactéries du sol sont énumérés et potentiellement cultivées et identifiés par étalement de dilutions. Ici, un échantillon de sol est en série dilué dans l’eau et ensuite dispersés sur des plaques de croissance d’agar. Les colonies qui en résultent sont alors comptées. Cette valeur, ainsi que le facteur de dilution, est utilisée pour élucider la concentration initiale de bactéries dans le sol.

Placage de dilution est une méthode simple pour la numération bactérienne et la commune, peu coûteux, mais il souffre de plusieurs inconvénients. Le sol ne puissent pas s’installer au cours de la dilution, qui pourrait conduire à une croissance biaisée. Certains sols bactéries pas la culture sur les plaques, ou poussent trop lentement à observer. En outre, cette méthode suppose que les colonies sont formés d’une seule bactérie, mais ils peuvent découler de l’amas de cellules multiples.

Certaines espèces bactériennes poussent mieux sur des milieux de culture différents. Un substrat commun à un large éventail de bactéries de la culture est une plaque de levure-peptone agar. Actinomycètes poussent préférentiellement sur les plaques de glycérol-caséine de base, qui est mieux adaptée à la croissance de ces bactéries filamenteuses.

Maintenant que vous comprenez le concept qui sous-tend l’énumération bactérienne, nous allons voir comment ce processus est effectué dans le laboratoire.

Pour commencer la procédure, peser 10 g d’échantillon de sol et ajouter à 95 mL d’eau désionisée. Bien agiter la suspension et qualifier de « A ». Avant que le sol s’affaisse, prélever 1 mL de la suspension avec une pipette stérile et transférez-le dans 9 mL d’eau désionisée. Vortex soigneusement et l’étiquette « B ».

Répétez cette étape de dilution 3 fois, chaque fois avec 1 mL de la suspension précédente et 9 mL d’eau désionisée. Ces étiquettes séquentiellement comme tubes C, D et E. Cela se traduit par des dilutions de 10-1 par le biais de 10-5 grammes / mL de sol.

Pour agrandir les colonies bactériennes, prenez 3 boîtes de gélose de levure-peptone préparés à l’avance et les qualifier de C, D et E. Vortex les échantillons correspondants et Pipeter 0,1 mL dans chaque assiette. Puisqu’on rapporte les UFC / mL à l’aide de 0,1 mL de plus augmente la dilution d’un facteur dix.

Ensuite, trempez un épandeur de verre dans l’éthanol. Placez le séparateur dans une flamme pendant quelques secondes à s’enflammer et brûler de l’éthanol. Cela va stériliser l’épandeur.

Maintenez l’épandeur au-dessus de la première plaque jusqu'à ce que la flamme s’éteint. Ouvrir la plaque rapidement, maintient le couvercle fermer par. Appuyer sur le séparateur à l’agar loin de l’inoculum pour refroidir et s’étend ensuite la chute d’inoculum autour de la surface jusqu'à disparaissent des traces de liquide. Replacez le couvercle de la plaque.

Re-flamme de l’épandeur et répétez le processus avec la plaquette suivante, travailler rapidement pour ne pas contaminer la plaque avec les organismes aéroportés. Inverser les plaques pour éviter l’humidité gouttes tombant sur la gélose et incuber les boîtes à température ambiante pendant une semaine.

Pour cultiver des actinomycètes, prendre trois plaques de glycérol-caséine préparés à l’avance et les qualifier de B, C et D. en utilisant les techniques décrites précédemment, insérer la plaque 0,1 mL de la suspension, B, C et D. Les dilutions inférieures sont utilisées car les actinomycètes sont généralement présentes sous forme de 1/10e de la population bactérienne.

Enfin, inverser ces plaques et le conserver à température ambiante pendant deux semaines.

Après incubation, examiner toutes les plaques de bactéries avec soin et notez les différences dans la forme et la taille de la colonie. Lorsqu’il est cultivé sur la gélose, bactéries produisent des colonies visqueux, allant de l’incolore à orange vif, jaune ou rose. En revanche, actinomycètes colonies sont calcaires, ferme, coriace et casseront sous pression, où autres colonies bactériennes seront salir. Cela permet aux colonies à se distinguer par le toucher avec une anse stérile.

Compter et noter le nombre de colonies bactériennes, y compris les actinomycètes. Ne compter que plaques avec 30-200 colonies par boîte.

Pour cultiver des cultures de bactéries individuelles spécifiques, sélectionner l’un des plaques, choisissant des colonies qui sont bien séparées des voisines des colonies des colonies isolées. Stériliser une boucle étalée, puis ouvrir la plaque et toucher la boucle à un espace vide pour refroidir. Ensuite, prendre une petite quantité de la colonie d’intérêt sur la boucle.

Prendre une plaque de peptone-levure fraîche, faire une strie de quelques centimètres long sur un côté. Stériliser et refroidir à nouveau, puis faire une rayure qui traverse le streak initial que sur la première passe. Répétez cette procédure deux fois plus de la même manière. Cette « dilution » trainage se traduit par des cellules sur la boucle étant séparés l’un de l’autre. Placer la plaque dans un endroit sombre à incuber à température ambiante pendant deux semaines.

Depuis le nombre de colonies bactériennes et les actinomycètes, les unités formant colonies par gramme de sol peut être déterminées. Le nombre de colonies par gramme de sol est égal au nombre de colonies dénombrées sur la plaque, multipliée par l’inverse de la dilution. Par exemple, si 46 colonies sont dénombrées dans une assiette de dilution de 10-5 avec un inoculum de 0,1 mL, puis l’UFC par gramme de sol est égale à 10-6 par 46 ou 46 millions UFC par gramme de sol.

Nombre de bactéries et de cultures est une première étape clée dans les nombreuses recherches scientifiques ou protocoles.

Sol sain contienne entre 106 et 108 bactéries par gramme. Énumération bactérienne du sol peut être utilisée pour déterminer la santé des sols d’intérêt et des comtes de moins de 106 et 108 bactéries par gramme indiquent sol malsain ou pauvre. Cela peut être causé par un manque de nutriments ou de matière organique, de stress abiotique en raison du pH du sol extrême, ou la contamination des sols.

Plusieurs types d’antibiotiques utilisés en médecine aujourd'hui furent initialement conceptualisés de sol logement bactérienne ou fongique. Isoler des souches pures de cultures de sol peut aide potentiellement aide scientifiques découvrir de nouveaux composés antibiotiques. Tester ici, des bactéries ou des composés isolés d’intérêt peuvent être ajoutés à plaques cultivés avec pelouses bactériennes, et leurs effets sur la croissance de la pelouse enregistrement. Patchs clairs dans les pelouses bactériennes où la croissance est inhibée par les bactéries de test ou composé peuvent indiquer une activité antibiotique.

Légumineuses, dont les pois et les haricots s’appuient sur des relations symbiotiques avec fixatrices d’azote bactéries. Ces bactéries vivent librement dans le sol ou à des nodules dans le système racinaire et produisent des composés d’azote qui sont utilisés par la plante. Dans les sols pauvres, complétant les légumineuses avec des bactéries fixatrices d’azote cultivées des sols pourrait stimuler la croissance et la santé des plantes. Cela peut entraîner chez les plantes plus grandes, plus robustes, qui à son tour donnent plus grand rendement des cultures.

Vous avez juste regardé introduction de JoVE d’énumération bactérienne. Vous devez maintenant comprendre comment effectuer des dilutions d’échantillons de sol, comment la plaque pour compter les colonies et l’isolement de la colonie et comment calculer le nombre de bactéries dans des échantillons de sol. Merci de regarder !

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