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Culturing e Enumerating Bactérias de Amostras de Solo
 
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Culturing e Enumerating Bactérias de Amostras de Solo

Overview

Fonte: Laboratórios do Dr. Ian Pepper e Dr. Charles Gerba - Universidade do Arizona
Autores de Demonstração: Bradley Schmitz e Luisa Ikner

Solos superficiais são uma mistura heterogênea de partículas inorgânicas e orgânicas que se combinam para formar agregados secundários. Dentro e entre os agregados estão vazios ou poros que contêm visualmente ar e água. Essas condições criam um ecossistema ideal para bactérias, de modo que todos os solos contêm vastas populações de bactérias, geralmente mais de 1 milhão por grama de solo.

Bactérias são os mais simples dos microrganismos, conhecidos como procariotes. Dentro deste grupo procariótico, há os micróbios filamentosos conhecidos como actinomycetes. Os actinomycetes são na verdade bactérias, mas são frequentemente considerados um grupo único dentro da classificação de bactérias por causa de sua estrutura filamentosa, que consiste em múltiplas células amarradas juntas para formar hifa. Este experimento usa mídia de caso de glicerol que selecionam para colônias de actinomyceto, durante a diluição e o revestimento. Normalmente, os actinomycetes são aproximadamente 10% da população bacteriana total. Bactérias e actinomycetes são encontrados em todos os ambientes da Terra, mas a abundância e diversidade desses micróbios no solo é incomparável. Esses micróbios também são essenciais para a vida humana e afetam o que as pessoas comem, bebem, respiram ou tocam. Além disso, existem espécies bacterianas que podem infectar pessoas e causar doenças, e existem bactérias que podem produzir produtos naturais capazes de curar pessoas. Actinomiccetos são particularmente importantes para a produção de antibióticos, como a estreptomicina. As bactérias são fundamentais para o ciclismo de nutrientes, crescimento vegetal e degradação de contaminantes orgânicos.

As bactérias são altamente diversas em termos do número de espécies que podem ser encontradas no solo, em parte porque são fisiologicamente e metabolicamente diversas. As bactérias podem ser heterotróficas, o que significa que utilizam compostos orgânicos, como glicose, para alimentos e energia, ou autotróficas, o que significa que utilizam compostos inorgânicos, como enxofre elementar, para alimentos e energia. Eles também podem ser aeróbicos, utilizando oxigênio para respiração, ou anaeróbico, utilizando formas combinadas de oxigênio, como nitrato ou sulfato, para respirar. Algumas bactérias podem usar oxigênio ou formas combinadas de oxigênio e são conhecidas como anaerobes facultativos.

Principles

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Uma maneira de enumerar o número de bactérias presentes em uma amostra de solo é utilizar a metodologia de diluição e revestimento. Essa metodologia utiliza o ágar como meio de crescimento bacteriano, um processo denominado "tecnologia cultural" Devido ao grande número de bactérias encontradas dentro dos solos, uma pequena amostra de solo é diluída em série na água, antes de ser banhado em ágar dentro de uma placa de Petri. Normalmente, uma pequena quantidade de solo contida dentro de 0,1 a 1 mL da suspensão do solo diluído é "espalhada" sobre a superfície da placa de ágar. As placas contêm ágar, que é derretido quando quente, mas sólido quando frio. Além do ágar, nutrientes, como levedura de peptona ou um produto comercialmente disponível como R2A, são adicionados ao meio para permitir o crescimento de bactérias heterotróficas.

Diluição e revestimento é uma tecnologia barata e relativamente simples para a enumeração das bactérias do solo. No entanto, existem várias desvantagens para a técnica. Alguns erros e suposições comuns associados à diluição e ensaios de revestimento são os seguintes: presume-se que cada bactéria do solo dá origem a uma colônia, mas na realidade uma colônia pode surgir de uma moita de células, resultando em uma subestimação da verdadeira contagem cultural. Durante a diluição seriada do solo, as partículas do solo podem se estabelecer (cair para o fundo), de modo que a verdadeira alíquota do solo não é transmitida para a próxima diluição. Muitos micróbios do solo são viáveis, mas não culturais. Bactérias de crescimento lento podem não resultar em colônias visíveis dentro de um período de tempo razoável (1-2 semanas).

Além disso, as bactérias anaeróbicas não crescem em condições aeróbicas, e as bactérias que crescem são selecionadas pelos nutrientes adicionados ao meio. Assim, R2A seleciona para bactérias heterotróficas, enquanto o enxofre elementar seleciona para oxidantes de enxofre autotrófico. No geral, estima-se que apenas 0,1 a 1% de todas as bactérias do solo podem ser cultivadas. Portanto, a diluição e o revestimento de bactérias do solo só explicam bactérias culturaveis e subestimam a verdadeira população viável do solo por uma a duas ordens de magnitude. Um exemplo de colônias bacterianas heterotróficas resultantes da diluição do solo e do revestimento é mostrado na Figura 1. Note que aproximadamente 1 milhão de células bacterianas são necessárias para que uma colônia seja visível a olho nu.

Este experimento demonstra a metodologia de diluição e difusão de revestimento utilizada para enumerar o número de bactérias dentro de uma amostra de solo. Especificamente, duas mídias são usadas: uma projetada para todas as bactérias, e outra que seleciona para actinomycetes. Uma vez que as colônias bacterianas tenham crescido nas placas de ágar, isole as culturas puras das colônias selecionadas usando uma técnica de placa de raia. Tais culturas puras podem então ser mais analisadas e caracterizadas para traços e funções específicas.

Figure 1
Figura 1. Colônias heterotróficas em uma placa de ágar R2A. Uma série de colônias discretas com morfologia diversificada surgem após a diluição e o revestimento do solo. Permissão de uso concedida pela Academic Press.

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Procedure

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1. Preparação de Diluições do Solo

  1. Para iniciar o procedimento, pese 10 g de amostra de solo e adicione a 95 mL de água deionizada. Agite bem a suspensão, e rotule como "A".
  2. Antes que o solo se instale, remova 1 mL da suspensão com uma pipeta estéril e transfira-a para uma água deionizada de 9 mL em branco. Vórtice completamente, e rotular como "B".
  3. Repita esta etapa de diluição três vezes, cada vez com 1 mL da suspensão anterior e uma água deionizada de 9 mL em branco. Rotule-os sequencialmente como tubos C, D e E. Isso resulta em diluições seriais de 10-1 a 10-5 gramas de solo por mL

2. Fazer placas de difusão para a cultura bacteriana

  1. Para cultivar colônias bacterianas, pegue três placas de ágar de peptone-levedura pré-preparadas e rotule-as como amostras C, D e E. Vortex C, D e E, e pipeta 0,1 mL em cada prato. Isso aumenta ainda mais o valor de diluição, por um fator de dez (C = 10-3, D = 10-4, E = 10-5).
  2. Em seguida, mergulhe um espalhador de vidro no etanol. Coloque o espalhador em chamas por alguns segundos para acender e queimar o etanol. Isso esterilizará o espalhador.
  3. Segure o espalhador acima da primeira placa até que a chama seja apagada. Abra a placa rapidamente, segurando a tampa por perto. Toque o espalhador para o ágar longe do áculo (Inoculum = células usadas para começar uma cultura) para esfriar, e depois espalhe a gota de inóculo ao redor da superfície do ágar até que traços de líquido livre desapareçam. Substitua a tampa da placa.
  4. Re-flame o espalhador e repita o processo com a próxima placa, trabalhando rapidamente para não contaminar o ágar com organismos aéreos
  5. Incubar as placas de bactérias à temperatura ambiente por 1 semana. Certifique-se de que as placas estão invertidas durante a incubação para evitar que gotas de umidade de condensação caiam sobre a superfície do ágar.

3. Fabricação de placas de difusão para Actinomycetes

  1. Para cultivar actinomycetes, pegue três placas de glicerol pré-preparadas e rotule-as como B, C e D. Utilizando as técnicas mostradas anteriormente, espalhe placa de 0,1 mL das suspensões B, C e D. As diluições mais baixas são utilizadas porque os actinomycetes estão tipicamente presentes como 1/10 da população bacteriana (B = 10-2, C = 10-3, D = 10-4).
  2. Incubar as placas de actinomycete (invertidas) à temperatura ambiente por 2 semanas.

4. Contagem de bactérias e actinomycetos

  1. Após a incubação, examine cuidadosamente todas as placas de bactérias e note diferenças no tamanho e forma da colônia. Quando cultivadas em ágar, as bactérias produzem colônias viscosas que vão de incolor a laranja brilhante, amarelo ou rosa. Em contraste, as colônias de actinomycete são calcéticas, firmes, de couro, e quebrarão sob pressão, onde outras colônias bacterianas irão manchar. Isso permite que as colônias sejam distinguidas pelo contato com um laço estéril.
  2. Conte e regise o número de colônias bacterianas, incluindo quaisquer actinomycetes. Só conte placas com 30-200 colônias por placa.

5. Isolamento de Culturas Puras

  1. Selecione colônias bacterianas individuais de qualquer uma das placas. Mais colônias podem ser selecionadas se houver interesse particular no solo. Use uma placa de diluição alta, pois tende a ter colônias puras que são bem separadas. Escolha apenas colônias bem separadas das colônias vizinhas e pareça morfologicamente distintas umas das outras.
  2. Esterilize o laço mergulhando-o em álcool e flamejando-o. Abra rapidamente a placa de Petri de interesse, e toque o laço em um ponto nu no ágar para esfriá-lo. Em seguida, remova uma pequena quantidade de uma colônia de interesse no loop.
  3. Tomando uma placa de levedura de peptone fresco, faça uma raia de alguns centímetros de comprimento de um lado. Esterilizar e esfriar novamente, depois faça uma raia que cruza a raia inicial apenas na primeira passagem. Repita este processo mais duas vezes da mesma maneira. Essa "diluição" de streaking resulta em células no loop sendo separadas umas das outras. Coloque a placa em uma área escura para incubar em temperatura ambiente por duas semanas.

Determinar uma contagem precisa de bactérias ambientais é fundamental para avaliar a saúde de um ecossistema de solo. Isso pode ser feito por colônias bacterianas com diluições apropriadas.

As bactérias do solo são uma parte importante de um ecossistema saudável do solo, desempenhando papéis na decomposição, fixação de nitrogênio e ciclismo de nutrientes. Solos superficiais são um substrato de partículas orgânicas e inorgânicas formando uma complexa matriz ao redor dos poros que se enchem de ar ou água. Essas condições criam um ecossistema ideal para bactérias, com solos superficiais tipicamente contendo mais de um milhão de bactérias por grama.

Devido a essa alta concentração de bactérias, a diluição é necessária antes de emplacar a mídia de crescimento. Diluições seriais podem reduzir a concentração da amostra original do solo a níveis baixos o suficiente para que colônias únicas sejam cultivadas em placas de mídia, permitindo o cálculo das contagens iniciais de bactérias na amostra do solo.

Este vídeo ilustrará como preparar diluições seriais de amostras de solo, como emplacar essas amostras bacterianas e como calcular a contagem bacteriana do solo a partir das placas de diluição.

As bactérias são organismos procarióticos simples, mas altamente diversos em termos de espécies e ecossistemas. Actinomycetes são um subconjunto de bactérias que são frequentemente consideradas um grupo único devido à sua estrutura filamentosa, onde crescem amarradas para formar hifa.

Normalmente, os actinomecetes representam 10% da população bacteriana total no solo. Bactérias e actinomycetes são abundantes em quase todos os ambientes da Terra, mas são encontrados em diversidade e abundância incomparáveis no solo.

As bactérias do solo são enumeradas, e potencialmente cultivadas e identificadas por revestimento de diluição. Aqui, uma amostra de solo é diluída em série na água, e depois dispersada em placas de crescimento de ágar. As colônias resultantes são então contadas. Esse valor, juntamente com o fator de diluição, é usado para elucidar a concentração inicial de bactérias no solo.

O revestimento de diluição é um método comum, barato e simples para enumeração bacteriana, mas sofre de várias desvantagens. O solo não deve ser permitido se instalar durante as diluições, o que poderia levar a um crescimento tendencioso. Algumas bactérias do solo não cultura nas placas, ou crescer muito lento para ser observado. Além disso, este método pressupõe que as colônias são formadas a partir de uma única bactéria, mas elas podem surgir de aglomerados de múltiplas células.

Certas espécies bacterianas crescem melhor em diferentes mídias de crescimento. Um substrato comum para cultivar uma ampla gama de bactérias é uma placa de levedura de ágar-peptone. Os actinomycetes crescem preferencialmente em placas à base de glicerol-caseína, que melhor se adequam ao crescimento dessas bactérias filamentosas.

Agora que você entende o conceito por trás da enumeração bacteriana, vamos ver como esse processo é realizado em laboratório.

Para iniciar o procedimento, pese 10 g de amostra de solo e adicione a 95 mL de água deionizada. Agite bem a suspensão, e rotule como "A". Antes que o solo se instale, remova 1 mL da suspensão com uma pipeta estéril e transfira-a para 9 mL de água deionizada. Vórtice completamente, e rotular como "B".

Repita esta etapa de diluição 3 vezes, cada vez com 1 mL da suspensão anterior e 9 mL de água deionizada. Rotule-os sequencialmente como tubos C, D e E. Isso resulta em diluições seriais de 10-1 a 10-5 gramas de solo por mL.

Para cultivar colônias bacterianas, pegue 3 placas de ágar de peptone-levedura pré-preparadas e rotule-as como C, D e E. Vortex as amostras correspondentes e pipeta de 0,1 mL em cada placa. Uma vez que as UFC são relatadas por mL, o uso de 0,1 mL aumenta ainda mais a diluição em um fator de dez.

Em seguida, mergulhe um espalhador de vidro no etanol. Coloque o espalhador em chamas por alguns segundos para acender e queimar o etanol. Isso esterilizará o espalhador.

Segure o espalhador acima da primeira placa até que a chama seja apagada. Abra a placa rapidamente, segurando a tampa por perto. Toque o espalhador para o ágar longe do inóculo para esfriar, e depois espalhe a gota de inóculo ao redor da superfície até que traços de líquido livre desapareçam. Substitua a tampa da placa.

Re-flameque o espalhador e repita o processo com a placa seguinte, trabalhando rapidamente para não contaminar a placa com organismos aéreos. Inverta as placas para evitar que a umidade caia sobre o ágar e incubar as placas à temperatura ambiente por uma semana.

Para cultivar actinomycetes, pegue três placas de glicerol pré-preparadas e rotule-as como B, C e D. Utilizando as técnicas mostradas anteriormente, espalhe placa de 0,1 mL das suspensões B, C e D. As diluições mais baixas são usadas porque os actinomycetes estão tipicamente presentes como 1/10 da população bacteriana.

Por fim, inverta essas placas e armazene à temperatura ambiente por duas semanas.

Após a incubação, examine cuidadosamente todas as placas de bactérias e note diferenças no tamanho e forma da colônia. Quando cultivadas em ágar, as bactérias produzem colônias viscosas que vão de incolor a laranja brilhante, amarelo ou rosa. Em contraste, as colônias de actinomycete são calcéticas, firmes, de couro, e quebrarão sob pressão, onde outras colônias bacterianas irão manchar. Isso permite que as colônias sejam distinguidas pelo contato com um laço estéril.

Conte e regise o número de colônias bacterianas, incluindo quaisquer actinomycetes. Só conte placas com 30-200 colônias por placa.

Para cultivar culturas de bactérias individuais específicas, selecione colônias discretas de qualquer uma das placas, escolhendo colônias bem separadas das colônias vizinhas. Esterilize um laço de espalhamento, depois abra a placa e toque o laço em um local vazio para esfriar. Em seguida, escolha uma pequena quantidade de interesse da colônia no circuito.

Tomando uma placa de levedura de peptone fresco, faça uma raia de alguns centímetros de comprimento de um lado. Esterilizar e esfriar novamente, depois faça uma raia que cruza a raia inicial apenas na primeira passagem. Repita este processo mais duas vezes da mesma maneira. Essa "diluição" de streaking resulta em células no loop sendo separadas umas das outras. Coloque a placa em uma área escura para incubar em temperatura ambiente por duas semanas.

A partir da contagem da colônia bacteriana e actinomycete, as Unidades de Formação de Colônias por grama de solo podem ser determinadas. O número de colônias por grama de solo é igual ao número de colônias contadas na placa, multiplicada pela recíproca da diluição banhada. Por exemplo, se 46 colônias são contadas em uma placa de diluição de 10-5 com uma vacina de 0,1 mL, então a UFC por grama de solo é igual a 10-6 por 46, ou 46 milhões de UFCas por grama de solo.

A realização de contagens e culturas bacterianas é um primeiro passo fundamental em muitas investigações científicas ou protocolos.

O solo saudável contém entre 106 e 108 bactérias por grama. A enumeração bacteriana do solo pode ser usada para determinar a saúde dos solos de interesse, e as contagens de menos de 106 e10 8 bactérias por grama indicam solo insalubre ou pobre. Isso pode ser causado pela falta de nutrientes ou matéria orgânica, estresse abiótico devido ao pH extremo do solo ou contaminação do solo.

Muitos tipos de antibióticos usados na medicina hoje foram identificados pela primeira vez a partir de bactérias ou fungos residentes no solo. Isolar cepas puras das culturas do solo pode ajudar a potencialmente ajudar os cientistas a identificar novos compostos antibióticos. Aqui, bactérias de teste ou compostos isolados de interesse podem ser adicionados a placas cultivadas com gramados bacterianos, e seus efeitos sobre o crescimento do gramado registrados. Manchas claras em gramados bacterianos onde o crescimento foi inibido pelas bactérias ou compostos de teste podem indicar atividade de antibióticos.

Plantas leguminous, incluindo ervilhas e feijões, dependem de relações simbióticas com bactérias fixadoras de nitrogênio. Essas bactérias vivem livremente no solo ou dentro de nódulos no sistema radicular, e produzem compostos de nitrogênio que são utilizados pela planta. Em solos pobres, a suplementação de culturas legúnus com bactérias cultivadas de fixação de nitrogênio dos solos pode impulsionar o crescimento e a saúde das plantas. Isso pode resultar em plantas maiores e mais duras, que por sua vez dão maior rendimento agrícola.

Você acabou de assistir a introdução do JoVE à enumeração bacteriana. Agora você deve entender como realizar diluições de amostras de solo, como emplacar para contagem de colônias e isolamento de colônias, e como calcular o número de bactérias em amostras de solo. Obrigado por assistir!

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Results

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Uma amostra de 10 g de solo com teor de umidade de 20% em base de peso seco é analisada para bactérias culturaveis viáveis através de técnicas de diluição e revestimento. As diluições foram feitas conforme mostrado na Tabela 1. 1 mL de solução E é derramado em um meio apropriado e resulta em 200 colônias bacterianas.

Equation 1

Mas, por 10 g de solo úmido,

Equation 2

Portanto

Equation 3

Passo Diluição
Solo de 10 g (peso/volume) Soro fisiológico de 95 mL (solução A) 10-1
Solução A de 1 mL (volume/volume) Solução salina de 9 mL (solução B) 10-2
Solução B de 1 mL (volume/volume) Solução salina de 9 mL (solução C) 10-3
Solução C de 1 mL (volume/volume) Soro fisiológico de 9 mL (solução D) 10-4
Solução D de 1 mL (volume/volume) Solução salina de 9 mL (solução E) 10-5

Tabela 1: Diluição e revestimento das amostras.

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Applications and Summary

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Existem duas aplicações fundamentais de diluição e revestimento de bactérias do solo. A primeira aplicação é a enumeração de bactérias culturais dentro de um determinado solo. A quantificação do número de bactérias do solo indica a saúde do solo. Por exemplo, se houver 106 a 108 bactérias culturable presentes por grama de solo, este seria considerado um número saudável. Um número inferior a 106 por grama indica pior saúde do solo, o que pode ser devido à falta de nutrientes encontrados em solos de baixa matéria orgânica; estresse abiótico imposto por valores extremos de pH do solo (pH < 5 ou > 8); ou toxicidade imposta por contaminantes antropogênicos orgânicos ou inorgânicos.

A segunda maior aplicação é a visualização e isolamento de culturas puras de bactérias. As culturas puras podem posteriormente ser caracterizadas e avaliadas para características específicas que podem ser úteis em aplicações médicas ou ambientais. Exemplos incluem: produção de antibióticos; biodegradação de orgânicos tóxicos; ou rizobia específica útil para fixação de nitrogênio por culturas legúminous, como ervilhas ou feijões.

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