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Analisi della curva di crescita batterica e sue applicazioni ambientali
 
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Analisi della curva di crescita batterica e sue applicazioni ambientali

Overview

Fonte: Laboratori del Dr. Ian Pepper e del Dr. Charles Gerba - Università dell'Arizona
Autore dimostrativo: Luisa Ikner

I batteri sono tra le forme di vita più abbondanti sulla Terra. Si trovano in ogni ecosistema e sono vitali per la vita di tutti i giorni. Ad esempio, i batteri influenzano ciò che le persone mangiano, bevono e respirano, e in realtà ci sono più cellule batteriche all'interno del corpo di una persona rispetto alle cellule di mammifero. A causa dell'importanza dei batteri, è preferibile studiare particolari specie di batteri in laboratorio. Per fare questo, i batteri vengono coltivati in condizioni controllate in coltura pura, il che significa che è in esame un solo tipo di batterio. I batteri crescono rapidamente in coltura pura e il numero di cellule aumenta drasticamente in un breve periodo di tempo. Misurando il tasso di aumento della popolazione cellulare nel tempo, si deve sviluppare una "curva di crescita". Questo è importante quando si mira a utilizzare o inoculare numeri noti dell'isolato batterico, ad esempio per migliorare la crescita delle piante, aumentare la biodegradazione di sostanze organiche tossiche o produrre antibiotici o altri prodotti naturali su scala industriale.

Principles

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La riproduzione batterica avviene tramite fissione binaria, in cui una cellula batterica si divide e diventa due cellule (Figura 1). Il tempo necessario per la divisione cellulare è noto come tempo medio di generazione, o tempo di raddoppio, che è il tempo necessario affinché il numero di cellule raddoppi.

Figure 1
Figura 1. Divisione cellulare esponenziale. Ogni divisione cellulare si traduce in un raddoppio del numero di celle. A bassi numeri di cellule, l'aumento non è molto grande; tuttavia, dopo alcune generazioni, il numero di cellule aumenta in modo esplosivo. Dopo n divisioni, ci sono 2n celle.

Per comprendere e definire la crescita di particolari microrganismi, vengono posti in un pallone, dove vengono controllati l'apporto di nutrienti e le condizioni ambientali. Se il mezzo liquido fornisce tutti i nutrienti necessari per la crescita e i parametri ambientali favorevoli alla crescita, l'aumento del numero può essere misurato in funzione del tempo per ottenere una curva di crescita. Diverse fasi di crescita distinte possono essere osservate all'interno di una curva di crescita (Figura 2). Questi includono la fase di ritardo, la fase esponenziale o logaritria, la fase stazionaria e la fase di morte, ognuna delle quali è associata a specifici cambiamenti fisiologici (Tabella 1).

Fase Caratteristiche
Fase di ritardo Crescita lenta o mancanza di crescita a causa dell'adattamento fisiologico delle cellule alle condizioni di coltura o della diluizione degli esoenzimi a causa della bassa densità cellulare iniziale.
Fase esponenziale o logarittiva Tassi di crescita ottimali, durante i quali il numero di cellule raddoppia a intervalli di tempo discreti noti come tempo medio di generazione.
Fase stazionaria La crescita (divisione cellulare) e la morte delle cellule si controbilanciano a vicenda con conseguente non aumento netto del numero di cellule. Il tasso di crescita ridotto è solitamente dovuto alla mancanza di sostanze nutritive e / o all'accumulo di costituenti di rifiuti tossici.
Fase di morte Il tasso di mortalità supera il tasso di crescita con conseguente perdita netta di cellule vitali.

Tabella 1. Le quattro fasi della crescita batterica.

Figure 2
Figura 2. Una curva di crescita tipica per una popolazione batterica. Confronta la forma delle curve in base alle unità formanti colonie (CFU) rispetto alla densità ottica, in particolare nella fase di morte. La differenza è dovuta al fatto che le cellule morte provocano ancora torbidità, ma non possono formare colonie vitali in coltura.

Nel complesso, è spesso fondamentale determinare la cinetica di crescita batterica per un dato isolato batterico, al fine di conoscere il numero di cellule batteriche presenti nel mezzo liquido. Esistono diversi modi per misurare la crescita in un mezzo liquido, comprese le misurazioni della torbidità utilizzando uno spettrofotometro colorimetrico e la placcatura di diluizione seriale. Le misurazioni della torbidità si basano sul fatto che più cellule sono presenti nel mezzo liquido, più torbido diventa il liquido. La placcatura di diluizione seriale comporta l'analisi del numero di cellule nel mezzo liquido che possono formare colonie vitali su coltura solida, una misura nota come "unità formanti colonie" della coltura. Si noti, tuttavia, che tali saggi di placcatura possono essere utilizzati solo per batteri che sono, di fatto, coltivabili.

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Procedure

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1. Raccolta delle aliquote di coltura batterica

  1. Un giorno prima della raccolta dei punti temporali di crescita, inoculare 20 mL di brodo di soia triptasi (TSB) in un matraccio da 50 ml con E. coli.
  2. Incubare durante la notte a 27 °C. Questo periodo di incubazione relativamente lungo si traduce in una popolazione in fase stazionaria di E. coli selvatico di circa 109 CFU/ml.
  3. Il giorno seguente, utilizzare 100 μL della coltura preparata per inoculare 250 mL di TSB (in un matraccio da 500 mL). Mescolare accuratamente.  Rimuovere un'aliquota di 5 ml e conservare immediatamente in frigorifero a 4 °C. Questo è T = 0 o T0 punto temporale e dovrebbe contenere circa 4 x 105 CFU / mL.
  4. Collocare il matraccio del rimanente E. coli (245 ml) in un incubatore vibrante a 37 °C. Rimuovere aliquote di coltura da 5 ml ogni ora, fino a 8 ore. Conservare ogni aliquota a 4 °C. Designare queste aliquote da T1 a T8.

2. Diluizione seriale

  1. Rimuovere le aliquote di E. coli dal frigorifero e metterle sul ghiaccio per il trasporto. Mantenere tutte le colture sul ghiaccio fino all'uso.
  2. Impostare una serie di tubi di diluizione per ottenere varie diluizioni di ciascuna coltura di E. coli (Figura 3). I tubi microfuga sono convenienti per questa funzione. Ogni tubo di diluizione deve avere 900 μL di liquido di diluizione (soluzione salina sterile). È necessaria una serie di diluizioni per ogni coltura di E. coli (da T0 a T8); etichettare ogni tubo secondo la Tabella 2.
    Figure 3
    Figura 3. Schema che mostra la procedura per la placcatura di E. coli.
  3. Iniziare le diluizioni aggiungendo 100 μL di E. coli dal tubo etichettato T0 (la coltura iniziale di E. coli) al tubo A, che è la diluizione 10-1 di T0. Vortice il tubo per 5 s.
  4. Successivamente, aggiungere 100 μL di Tubo A al successivo tubo di soluzione salina, Tubo B, che è la diluizione 10-2 di T0. Continuare la serie di diluizione necessaria per ogni aliquota del punto temporale. Ricorda di vorticosare ogni tubo prima del trasferimento. È anche importante utilizzare una nuova punta della pipetta per ogni trasferimento.
Coltura di E. coli Diluizioni necessarie e tubo #
Un B C D E F G
T0 10-1 10-2
T1 10-1 10-2
T2 10-1 10-2 10-3
T3 10-1 10-2 10-3 10-4
T4 10-1 10-2 10-3 10-4 10-5
T5 10-1 10-2 10-3 10-4 10-5 10-6
T6 10-1 10-2 10-3 10-4 10-5 10-6 10-7
T7 10-1 10-2 10-3 10-4 10-5 10-6
T8 10-1 10-2 10-3 10-4 10-5 10-6

Tabella 2. Serie di diluizione richieste per ogni coltura di E. coli.

3. Placcatura

  1. Saranno placcate tre diluizioni per ogni aliquota del punto temporale di coltura di E. coli, secondo la Tabella 3. Etichettare le piastre con il punto temporale (da T1 a T8),il fattore di diluizione e il volume da aggiungere. Utilizzare piastre triplicate per ogni diluizione.
  2. Aggiungere 100 μL di ogni diluizione alla piastra pipettando la quantità al centro della piastra di agar (Figura 3). Distribuire immediatamente l'aliquota utilizzando un'asta di vetro a forma di "L" sterilizzata a fiamma. Se l'aliquota non viene diffusa immediatamente, assorbe in situ sulla piastra, con conseguente crescita eccessiva batterica nel punto di inoculazione iniziale.
  3. Ripetere la placcatura per ogni serie di diluizione per i punti temporali da T1 a T8. Ricordarsi di sterilizzare l'asta tra le piastre e soprattutto tra le diverse diluizioni.
  4. Una volta che le piastre si sono asciugate per alcuni minuti, invertire e posizionare in un incubatore a 37 °C durante la notte. L'inversione delle piastre impedisce alla condensa di cadere sulla piastra di agar. Dopo l'incubazione notturna, le piastre devono essere conservate in frigorifero.
Coltura di E.coli Diluizioni da placcare
T0 10-1 10-2 10-3
T1 10-1 10-2 10-3
T2 10-2 10-3 10-4
T3 10-3 10-4 10-5
T4 10-4 10-5 10-6
T5 10-5 10-6 10-7
T6 10-6 10-7 10-8
T7* 10-5 10-6 10-7
T8* 10-4 10-5 10-6

* Le diluizioni più basse tengono conto delle popolazioni più basse a causa della fase di morte.

Tabella 3. Protocollo di placcatura per colture di E. coli.

4. Conteggio delle colonie e calcolo del tempo medio di generazione

  1. Esaminare le piastre per l'uniformità delle colonie e la mancanza di contaminazione.
  2. Per ogni punto temporale (da T0 a T8),scegli una diluizione che contiene tra 30 e 300 colonie e conta le piastre triplicate.
  3. Utilizzando il fattore di diluizione, calcolare a ricalcolo il numero di cellule per mL di coltura originale nei punti temporali da T0 a T8. Ad esempio, se il numero di colonie risultanti da una diluizione10 -4 è 30, 28 e 32:
    Numero medio di colonie = 30 colonie
    Questi sono nati da 0,1 ml di una diluizione 10-4
    Numero di colonie per mL = 30 x 104 = 3 x 106
  4. Plot log10 CFU/mL rispetto al tempo (in ore).
  5. Dal grafico, identifica la fase esponenziale della crescita. Utilizzando 2 punti temporali all'interno della fase di crescita esponenziale e i numeri di cella corrispondenti in ogni momento, calcolare il tempo medio di generazione.

Misurare il tasso di crescita dei batteri è una tecnica microbiologica fondamentale e ha un uso diffuso nella ricerca di base e nelle applicazioni agricole e industriali.

I batteri sono tra le forme di vita più abbondanti sulla Terra, essendo presenti in ogni ecosistema, incluso il corpo umano. Alcune specie batteriche sono anche geneticamente altamente trattabili e sono state sfruttate come modelli di ricerca o per produrre prodotti naturali o sintetici su scala industriale. Tuttavia, non tutte le specie batteriche possono essere coltivate in laboratorio. Per quelli che possono, una caratteristica importante è il tasso di moltiplicazione, o "cinetica di crescita".

Misurare il tasso di crescita di una coltura batterica può informare gli scienziati sulle loro funzioni fisiologiche e metaboliche ed è anche utile per ottenere un numero preciso di cellule dei batteri per applicazioni a valle.

Questo video introdurrà i principi alla base dell'analisi del tasso di crescita batterica, dimostrerà un protocollo per caratterizzare il tasso di crescita con una "curva di crescita" e, infine, esplorerà diverse applicazioni di scienze ambientali per misurare la cinetica della crescita batterica.

I batteri generalmente si riproducono asessualmente, moltiplicandosi per la semplice fissione binaria in cui una cellula parentale si divide in due cellule figlie identiche. In condizioni di crescita favorevoli in cui i nutrienti sono disponibili in abbondanza e i parametri ambientali come la temperatura sono tutti favorevoli alla crescita, il tasso di moltiplicazione supera di gran lunga il tasso di mortalità. Ciò si traduce in una crescita esponenziale.

Misurando la quantità di batteri in una coltura in funzione del tempo, è possibile ottenere una curva di crescita. La crescita di batteri in una coltura liquida in condizioni ottimali produce una curva di crescita con una forma caratteristica che può essere suddivisa in varie fasi. La curva inizia con una "fase di ritardo", quando la crescita è lenta mentre i batteri si acclimatano alle condizioni di coltura. Il prossimo è il "log" o "fase esponenziale", quando i batteri sperimentano una crescita esponenziale. La crescita alla fine si blocca una volta che i nutrienti si esauriscono e i prodotti di scarto si accumulano, risultando in una "fase stazionaria". Infine, una volta che il tasso di moltiplicazione è superato dal tasso di morte cellulare, la coltura entra nella "fase di morte".

Per costruire una curva di crescita, i numeri batterici in un pallone di coltura liquida vengono contati in diversi punti temporali durante un certo periodo di coltivazione. La conta batterica può essere ottenuta con una serie di metodi diversi. Un approccio comune è quello di misurare la densità ottica - o "OD" - 600, che è l'assorbanza della luce della soluzione batterica a una lunghezza d'onda di 600 nm.

Un altro metodo è quello di determinare il "CFU", o unità formanti colonie, per millilitro della coltura. A causa della natura clonale della crescita batterica, un batterio in una coltura può teoricamente espandersi in una colonia osservabile su una piastra di agar. Placcando una serie di diluizioni di una coltura batterica per raggiungere una concentrazione batterica in cui è possibile osservare colonie individuali e discrete, un metodo chiamato "placcatura di diluizione seriale", il conteggio delle colonie può essere utilizzato per calcolare a ricalcolo la concentrazione batterica in termini di CFU per mL.

Ora che hai capito come la crescita batterica può essere analizzata, passiamo attraverso un protocollo per condurre l'analisi della curva di crescita su colture pure di un modello batterico ben consolidato, Escherichia coli, utilizzando il metodo di placcatura di diluizione seriale.

Un giorno prima della raccolta del punto temporale, inoculare 20 mL di brodo di soia triptasi pre-sterilizzato, o TSB, mezzo in un matraccio da 50 ml con una singola colonia di E. coli.

Incubare la coltura durante la notte a 37 °C con agitazione. Per E. coli, ciò comporterebbe una popolazione in fase stazionaria di circa 109 CFU/ml.

Il giorno seguente, inoculare 100 μL della coltura notturna in 250 mL di TSB in un matraccio da 500 mL. Mescolare accuratamente. Questo produce una coltura diluita di circa 4 x 105 CFU/ml. Conservare 5 ml di questa coltura diluita in un tubo di coltura. Questa è l'aliquota dal punto temporale 0, o T0. Conservare in frigorifero immediatamente a 4 °C.

Incubare il volume rimanente della coltura a 37 °C con agitazione. Ogni ora successiva per un massimo di 8 ore, raccogliere aliquote da 5 ml dalla coltura. Designare questi campioni da T1 a T8e conservarli tutti a 4 °C fino all'uso.

Il giorno dell'esperimento, rimuovere le aliquote del punto temporale di E. coli dal frigorifero e tenerle sul ghiaccio. Utilizzare tubi di microfuga sterili, ciascuno con 900 μL di soluzione salina sterile, per impostare una serie di diluizione per ogni aliquota secondo la seguente tabella.

Mescolare bene lacoltura T 0 ruotando delicatamente, quindi aggiungere 100 μL al tubo A della sua serie di diluizione, facendo una diluizione 1 in 10 o 10-1. Vortex Tube A per mescolare e, utilizzando una punta di pipetta fresca, aggiungere 100 μL di Tube A al Tube B, facendo la diluizione 1-in-100 o 10-2.

Ripetere il processo per ogni aliquota di coltura e fare la serie di diluizione appropriata secondo la tabella 2. Una volta effettuata la serie di diluizione per tutti i campioni di punti temporali, preparare il numero appropriato di piastre sterili di agar di soia triptasi per la placcatura batterica.

3 diluizioni di ogni coltura di punti temporali saranno placcate in triplice secondo la seguente tabella. Etichettare le piastre di conseguenza. Quindi, pipettare 100 μL di ogni coltura opportunamente diluita sul centro della rispettiva piastra di agar. Sterilizzare a fiamma un'asta di vetro a forma di "L", raffreddare toccando l'asta all'agar lontano dall'inoculo e distribuire immediatamente il liquido sulla superficie dell'agar. Si prega di notare che un ritardo nella diffusione potrebbe causare una crescita eccessiva batterica nel punto dell'inoculazione.

Continuare a placcare ogni serie di diluizione per tutte le colture a 9 punti temporali, sterilizzando a fiamma l'asta di diffusione del vetro tra ciascuna serie di diluizione.

Una volta che le piastre sono state lasciate asciugare per alcuni minuti, invertitele e mettete nell'incubatrice a 37 °C durante la notte. Dopo questo periodo di crescita, le piastre possono essere conservate a 4 °C.

Dopo l'incubazione notturna delle piastre di diluizione, esaminarle per la contaminazione e l'uniformità delle colonie. Per ogni coltura del punto temporale, scegli una diluizione per la quale ci sono tra 30-300 colonie per piastra. Contare il numero di colonie su ciascuna delle piastre triplicate per quella diluizione.

Utilizzando il numero medio di colonie per ogni diluizione e il fattore di diluizione, calcolare la concentrazione di batteri nella coltura originale in ogni punto temporale in CFU/mL. Ad esempio, se ci sono in media 30 colonie dal set di piastre triplicate ottenute da 0,1 mL della diluizione10 -4, o 1 su 10.000, allora ce ne sarebbero 30 divise per 0,1 ml moltiplicate per 10.000, o 3 milioni di CFU / mL.

Utilizzando la concentrazione batterica calcolata per ogni punto temporale, tracciare un grafico del log in base 10 delle concentrazioni batteriche, in CFU/mL, rispetto al tempo in ore. Dal grafico, identificare la fase di log di crescita della coltura batterica originale e scegliere due dei punti temporali all'interno della fase log, designando il primo di questi punti temporali come t = 0. Calcola il tempo medio di generazione usando l'equazione X uguale a 2 alla potenza di n moltiplicata per X0 dove X è la concentrazione batterica al tempo t, X0 è la concentrazione iniziale a t = 0 e n è il numero di generazioni trascorse tra i due punti temporali.

Ad esempio, supponiamo che X0 sia 1.000 CFU/mL e che a t = 6 h la concentrazione sia di 16.000 CFU/mL. Usando l'equazione, otteniamo che 4 generazioni si sono verificate entro 6 ore, il che dà un tempo di generazione di 6 diviso per 4 o 1,5 ore per generazione.

La misurazione della cinetica di crescita batterica è fondamentale per molte applicazioni per scopi di ricerca, agricoltura o bioingegneria.

Un uso per conoscere il tasso di crescita batterica è quello di consentire una quantità accurata di una coltura batterica da ottenere per inoculare un'altra coltura o mezzo. Ad esempio, alcune colture, come i legumi, devono essere coltivate con batteri simbiotici noti come rizobia che colonizzano le radici delle piante per formare noduli e "fissare" l'azoto - convertendo l'azoto atmosferico in ammoniaca che può essere utilizzata dalla pianta. Per le applicazioni agricole, una quantità nota di rizobia viene aggiunta a un mezzo di carbonio a base di torba, che viene quindi utilizzato per inoculare i semi di legumi per stabilire la simbiosi pianta-batterio.

L'analisi della crescita può anche essere utilizzata per identificare specie batteriche che possono degradare i rifiuti industriali e possibilmente generare sottoprodotti preziosi. In questo esempio, i ricercatori hanno studiato come i mezzi di crescita integrati con il liquore nero, un prodotto di scarto della polpa di legno e della produzione di carta, abbiano influenzato la crescita di un isolato microbico ambientale.

I batteri non solo hanno dimostrato una maggiore crescita con il liquore nero, ma hanno anche mostrato un modello di crescita "difasico", indicando la presenza di più di una fonte di carbonio nel liquore nero che i batteri possono metabolizzare. I singoli componenti del liquore nero potrebbero quindi essere estratti per un'analisi della crescita più dettagliata.

Infine, le misurazioni del tasso di crescita sono utili anche per caratterizzare i batteri che sono stati progettati per particolari scopi industriali, ad esempio per la bonifica dell'inquinamento da petrolio. Qui, gli scienziati hanno creato ceppi batterici geneticamente modificati che contengono enzimi per degradare i componenti idrocarburici del petrolio. L'analisi della crescita è stata eseguita, ad esempio, per verificare che i batteri ingegnerizzati hanno aumentato il tasso di crescita rispetto ai batteri normali in presenza di idrocarburi tossici, indicando una migliore tolleranza che consentirà ai batteri ingegnerizzati di svolgere la loro funzione di pulizia dell'inquinamento.

Hai appena visto il video di JoVE sull'analisi dei tassi di crescita batterica con le curve di crescita. Ora dovresti capire le diverse fasi di crescita delle colture batteriche, come eseguire un esperimento per ottenere una curva di crescita utilizzando la raccolta di punti temporali e la placcatura di diluizione seriale e come l'analisi della crescita può essere applicata alla ricerca e agli scopi industriali. Come sempre, grazie per aver guardato!

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Results

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A seguito di un esperimento di placcatura di diluizione seriale, sono stati ottenuti i seguenti dati. All'inizio della crescita esponenziale qui designata come tempo t = 0, la concentrazione iniziale di cellule batteriche è di 1.000 CFU / mL. Al tempo t = 6 h, la concentrazione delle cellule è di 16.000 CFU/mL.

Ora, X = 2n x X0

Dove: X0 = concentrazione iniziale di cellule = 1.000 CFU/mL
X = concentrazione di cellule dopo il tempo t = 16.000 CFU/mL
n = numero di generazioni
16.000 = 2n x 1.000
2n = 16
log10 2n = log10 16
n x 0,301 = 1,204
n = 1,204 = 4
0.301

Sono trascorse quattro generazioni in 6 ore, quindi

Tempo medio di generazione = 6/4 = 1,5 h.

Figure 4
Figura 4. Un nodulo radicale che contiene batteri che fissano l'azoto.

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Applications and Summary

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La conoscenza della cinetica di crescita batterica e dei numeri batterici in un terreno di coltura è importante sia dal punto di vista della ricerca che da quello commerciale. Nella ricerca, è spesso fondamentale conoscere il numero di batteri in un campione, in modo che l'esperimento possa essere replicato, se necessario, con gli stessi identici numeri. Ad esempio, durante gli esperimenti in cui gli inoculanti batterici vengono aggiunti a un appezzamento di terreno, è necessario aggiungere un minimo di10 4 CFU per grammo di terreno per ottenere l'effetto desiderato, come una maggiore biodegradazione dei contaminanti organici tossici del suolo. Un altro esempio è il caso degli inoculanti rizobiali prodotti commercialmente, in cui un numero noto di rizobia (batteri che entrano in relazioni simbiotiche con le radici delle piante) sono impregnati in un mezzo di carbonio a base di torba (Figura 4). Il mezzo viene quindi utilizzato per inoculare i semi di legumi per migliorare la fissazione biologica dell'azoto(cioèla conversione dell'azoto molecolare in forme organiche che possono essere utilizzate dagli organismi come nutrienti).

La cinetica di crescita è anche utile per valutare se particolari ceppi di batteri sono adattati per metabolizzare determinati substrati, come i rifiuti industriali o l'inquinamento da petrolio. I batteri geneticamente modificati per ripulire le fuoriuscite di petrolio, ad esempio, possono essere coltivati in presenza di idrocarburi complessi per garantire che la loro crescita non sia repressa dagli effetti tossici del petrolio. Allo stesso modo, la pendenza e la forma delle curve di crescita prodotte da batteri cresciuti con miscele di prodotti di scarto industriale possono informare gli scienziati se i batteri possono metabolizzare la particolare sostanza e quante potenziali fonti di energia per i batteri possono essere trovate nella miscela di rifiuti.

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