Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Science Education
Organic Chemistry II

A subscription to JoVE is required to view this content.
You will only be able to see the first 20 seconds.

 
Click here for the English version

סינתזת פאזה מוצקה

Overview

מקור: Vy M. דונג ודיאן לה, המחלקה לכימיה, אוניברסיטת קליפורניה, אירווין, קליפורניה

הסינתזה המוצקה של מריפילד היא המצאה זוכת פרס נובל שבה מולקולה מגיבה קשורה לתמיכה מוצקה ועוברת תגובות כימיות רצופות כדי ליצור תרכובת רצויה. כאשר המולקולות קשורות לתמיכה מוצקה, ריאגנטים עודפים ותוצרי לוואי ניתן להסיר על ידי שטיפת זיהומים, בעוד תרכובת היעד נשאר קשור שרף. באופן ספציפי, אנו להציג דוגמה של סינתזת פפטיד שלב מוצק (SPPS) כדי להדגים את הרעיון הזה.

Principles

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

סינתזה שלב מוצק היא שיטה המשמשת לייעול הסינתזה של מולקולות. הוא משמש לעתים קרובות בכימיה קומבינטורית (טכניקה המשמשת להכנת מספר רב של מולקולות בפרק זמן קצר), כדי ליצור ספריות של תרכובות בשל קלות הטיהור, וסינתזה כימית הכוללת. סינתזה שלב מוצק בדרך כלל כרוך בשימוש בשרף; חומר לא מסיס, מבוסס פולימר, אשר פונקציונלי מראש כך אבן הבניין מתחיל יכול בקלות לאגד. אבני הבניין מוגנות בדרך כלל לאחר הוספתן לשרף, וניתן הגנה וטיפול בהן בקלות עם אבן הבניין הרצויה הבאה בפתרון (איור 1). לאחר המולקולה הרצויה כבר מסונתז, זה יכול בקלות להיות מבקע מן השרף.

מכיוון שהוא חזק, סינתזה מוצקה שימש לסנתז חומצות גרעין, אוליגוסכרידים, והכי נפוץ, פפטידים. התגלה ודווח על ידי רוברט ברוס מריפילד בשנת 1963, SPPS הפך השיטה הנפוצה ביותר ליצירת ספריות של פפטידים. מריפילד זכה בפרס נובל להמצאת SPPS לשנת 1984. SPPS יכול בקלות לנצל Fmoc (בסיס רגיש) או Boc (חומצה רגיש)N- הגנה על חומצות אמינו לבנות ספריות של פפטידים בפרק זמן קצר. HBTU (סוכן צימוד) ו- i-Pr2EtN (בסיס) להפעיל את C-טרמינל של חומצת האמינו עבור צימוד עם חומצת אמינו אחרת. Fmoc הגנה על קבוצות ניתן להסיר על ידי 4-מתילפיפרידין, בעוד קבוצות הגנה Boc ניתן להסיר על ידי חומצות חזקות כגון חומצה trifluoroacetic. בניסוי זה, אנו להדגים SPPS באמצעות סינתזה של dipeptide. נשתמש במבחן קייזר, שיטה איכותית לבדיקת נוכחות של אמינים ראשוניים, כדי לעקוב אחר התקדמות התגובה.

Figure 1
איור 1. מושג מאחורי סינתזת פפטיד שלב מוצק (SPPS).

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Procedure

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

1. טעינת השרף

  1. לכלי סינתזה פפטיד 100mL, להוסיף 2-כלורוטיל כלוריד (CTC) שרף (1.1 mmol/ g, 0.360 גרם, 0.400 mmol). הוסף 20 מ"ל DMF ולאפשר להם להתנפח במשך 30 דקות תחת N2.
  2. מסננים את החרוזים תחת ואקום ומוסיפים 10 מ"ל DMF.
  3. יש להוסיף 500 מ"ג Fmoc-Ala-OH (1.60 מ"ל) ו-2.5 מ"ל i-Pr2EtN, ומערבבים מתחת ל-N2 במשך 15 דקות.
  4. מסננים את הממס תחת ואקום וחוזרים על הטעינה עם Fmoc-Ala-OH במשך 15 דקות.
  5. מסננים את הממס תחת ואקום לשטוף את החרוזים עם 10 מ"ל DMFunder N2, ולנקז תחת ואקום 3x.

2. הסרת ההגנה של קבוצת Fmoc

  1. מוסיפים 10 מ"ל 20% 4-מתילפיפרידין ב- DMF ומערבבים את החרוזים מתחת ל- N2 במשך 15 דקות.
  2. מסננים את הממס תחת ואקום וחוזרים על ההגנה.
  3. לשטוף את החרוזים עם 10 מ"ל DMF תחת N2 ולנקז תחת ואקום 3x.

3. ביצוע מבחן הקייזר

  1. בצע את מבחן קייזר על ידי הוספת 1-2 טיפות של פתרון A (0.5 מ"ל 0.01 M KCN, 24.5 מ"ל פירידין), פתרון B (1 גרם ניינהידרין, 20 מ"ל n-butanol), ופתרון C (20 גרם פנול, 10 מ"ל n- butanol) כל אחד לתוך שתי מבחנות. מבחנה אחת תהיה השליטה ואילו השנייה תפקח על התגובה.
  2. הוסף כמה חרוזים של שרף מכלי התגובה מבחנה תגובה לחמם את שתי המבחנות ל 110 °C (50 °F).
  3. אם ההגנת הושלמה, התוכן של המבחנה יהפוך צבע כחול כהה / סגול. אם הסרת ההגנה אינה שלמה או נכשלה, הפתרון יישאר צהוב. השווה את מבחנה התגובה עם מבחנה הבקרה.

4. צימוד אבני הבניין הבאות

  1. מסננים את הממס תחת ואקום.
  2. לשטוף את החרוזים עם 10 מ"ל N-מתיל-2-פירולידון תחת N2 ולנקז את הממס תחת ואקום.
  3. כדי להתחיל את הזיווג הבא, להוסיף 10 מ"ל NMP, 620 mgFmoc-Phe-OH (1.6 mmol), 610 מ"ג HBTU (1.6 mmol), ו 2.5 מ"לi-Pr2EtN, ולאפשר את השרף לבעבע מתחת N2 במשך 30 דקות.
  4. מסננים את הממס תחת ואקום.
  5. לשטוף את החרוזים עם 10 מ"ל DMF תחת N2 ולנקז תחת ואקום 3x.
  6. בצע את מבחן קייזר (ראה שלבים 3.1-3.3) כדי לחפש את השלמת הצימוד. החרוזים והפתרון במבחנה צריכים להיות צהובים.

5. מבקע את הפפטיד מהשרף

  1. Cleave קבוצת Fmoc הנותרת באמצעות שלבים 2.1-2.3.
  2. לאחר הממס מנוקז תחת ואקום, להוסיף פתרון מחשוף 40 מ"ל (95% TFA, 2.5% H2O, 2.5% טיפים) לשרף ובועה תחת N2 עבור 3 שעות.
  3. מניחים בקבוקון קבלה חדש על סינתיסייזר הפפטיד ומנקזים את תמיסת ה-TFA המכילה את הפפטיד הרצוי תחת ואקום לתוך הבקבוקון החדש.

6. משקעים ואני זוחלים של הפפטיד

  1. הפרד את פתרון TFA ל -4 בקבוקונים חרוטים והוסף אתר קר 25 מ"ל (−20 °C (70 °F) לכל בקבוקון כדי לזרז את הפפטיד.
  2. צנטריפוגה הבקבוקונים (3,000 סל"ד, 0-4 מעלות צלזיוס) במשך 20 דקות. זלזלו בפתרון TFA ואתר הנותרים מהבקבוקונים החרוטים ורכזו את משקעים הפפטידים כדי להרשות לעצמם את הדיפפטיד הרצוי כמוצק לבן.

סינתזת פאזה מוצקה היא שיטה שבה המוצר מסונתז בעודו קשור לחומר בלתי מסיס.

סינתזת פאזה מוצקה משמשת לעתים קרובות לייצור אוליגומרים ביולוגיים ופולימרים כגון פפטידים, חומצות גרעין, ואוליגוסכרידים. מולקולות אלה מורכבות משרשראות של תת-יחידות מולקולריות קטנות יותר, הנקראות מונומרים. סינתזה של אוליגומר או פולימר נוקטת צעדים רבים, שכן יש להוסיף את המונומרים בסדר הנכון.

בעיה עם סינתיסייזרים רב-שלביים היא כי טיהור ובידוד של המוצרים היציבים של כל צעד, הנקראים מוצרי ביניים, מקטין את התשואה הכוללת. בסינתזת שלב מוצק, מוצר הביניים נשאר קשור לתמיכה המוצקה לאורך כל הסינתזה. זה מאפשר ריאגנטים שלב פתרון, ממסים, ותוצרי לוואי להישטף, ביטול הצורך לטהר ולבודד כל מוצר ביניים בין שלבים.

וידאו זה ימחיש את ההליך עבור סינתזת פפטיד שלב מוצק ולהציג כמה יישומים של סינתזה שלב מוצק בכימיה.

בסינתזה של פאזה מוצקה, מולקולה מסונתזת על תמיכה מוצקה ברצף של תגובות. לדוגמה, אוליגומר או פולימר יהיה מסונתז מונומר אחד בכל פעם כדי ליצור את המוצר הסופי. האוליגומר או הפולימר הגדלים נשארים קשורים מאוד לתמיכה המוצקה עד שהוא מופרד, או מקובע, מהתמיכה עם ריאגנטים.

לכל מונומר חייבים להיות לפחות שני אתרים מחייבים כדי להיות חלק משרשרת הפולימרים, אך רק אתר כריכה אחד יכול להיות זמין בכל פעם כדי להבטיח שהמונומר ייקשר לאטום הנכון. זה מושג עם קבוצות הגנה, שהן קבוצות פונקציונליות שאינן מגיבות במהלך שלב אחד או יותר של הסינתזה. אתר הכריכה משוחזר, או מוגן, על ידי טיפול במולקולה עם ריאגנטים ספציפיים להמיר את קבוצת ההגנה לקבוצה פונקציונלית תגובתית.

כדי להתחיל סינתזה שלב מוצק, החומר ההתחלתי מאוגד שרף שתוכנן במיוחד או פולימר מסיס באתר הכריכה הזמין היחיד שלה. לאחר מכן, חומר ההתחלה הכבול הוא deprotected כדי לאפשר כריכה של המונומר השני בשרשרת. לאחר מכן, מתווסף פתרון של המונומר השני בשרשרת, יחד עם סוכן צימוד כדי להקל על הקשר בין המונומרים.

ברגע שהמונומר השני נקשר לחומר ההתחלתי, מוצר הביניים הדימרי המתקבל מוגדר כהגנה. תהליך זה חוזר על עצמו עד שהמטרה אוליגומר או פולימר נוצר. המוצר מבקע מהתמיכה המוצקה לפתרון, שממנו ניתן לטהר אותו, לבודד ולנתח אותו.

סינתזה פאזה מוצק משמש לעתים קרובות עבור סינתזה של פפטידים, שהם שרשראות של חומצות אמינו. חומצות אמינו יש קבוצת אמין, קבוצת קרבוקסיל, ומחליף, או "שרשרת צד". האמין מוגן בתחילה. לאחר הגנה, האמין יוצר קשר פפטיד עם קבוצת קרבוקסיל של חומצת האמינו הבאה.

עכשיו שאתם מבינים את העקרונות של סינתזת פאזה מוצקה, בואו נעבור הליך לסינתזת פפטיד פאזה מוצקה, שבו נדגים את התוספת של שתי חומצות האמינו הראשונות.

כדי להתחיל את ההליך, חבר בקבוקון קבלה לפסולת לכלי סינתזה פפטיד ידני 100 מ"ל. ואז למקם 0.360 גרם של 2-כלורוריטיל כלוריד שרף לתוך הכלי. חבר קו גז חנקן לאחם כלי הדם וקו ואקום למתאם הצינור המשון.

הוסף 20 מ"ל של דימתילפורמיד לשרף ולאפשר חרוזי שרף להתנפח במשך 30 דקות תחת זרימה של גז חנקן. לאחר מכן, להחיל ואקום כדי לנקז את הממס.

הוסף 10 מ"ל של DMF, 1.6 mmol של חומצת אמינו מוגנת Fmoc, ו 2.5 מ"ל של N,N-diisopropyl אתילאמין לכלי. בועה מתחת לגז החנקן, אשר מערבב את הפתרון, במשך 15 דקות כדי לטעון את חומצת האמינו המוגנת על השרף.

הסר את הממס תחת ואקום ולבצע טעינה שנייה. לאחר הסרת הממס, להסעיר את חרוזי שרף טעון שלוש פעמים בחלקים 10 מ"ל של DMF, לנקז כל לשטוף לתוך הבקבוקון המקבל.

לאחר מכן, להוסיף חרוזים טעונים 10 מ"ל של פתרון 20% של 4-מתילפיפרידין ב- DMF. בועה את התערובת במשך 15 דקות כדי להסיר את קבוצת Fmoc.

מסננים את הממס וחוזרים על הליך ההגנת. לשטוף ולנקז את השרף הטעון שלוש פעמים, כמו קודם. לאחסן את החרוזים תחת ממס עד שהם מוכנים לשלב הבא.

כדי לוודא כי המתחם הטעון היה מוגן לחלוטין, מקום ראשון 1 עד 2 טיפות של כל פתרון מבחן קייזר בשתי מבחנות.

מניחים כמה חרוזים טעונים במבחנה ומחממים את שני הצינורות ל -110 מעלות באמבט שמן. Deprotection הושלם אם תערובת שרף הופך כחול כהה לסגול, המציין את נוכחותם של קבוצות אמין בתערובת.

כדי להתחיל את שלב הצימוד, ראשית לשטוף את החרוזים עם 10 מ"ל של NMP תחת זרימה של גז N2.

לאחר מכן, להוסיף 10 מ"ל של NMP, 1.6 mmol של חומצת האמינו הבאה מוגן Fmoc, 1.6 mmol של סוכן צימוד HBTU, ו 2.5 מ"ל של DIPEA לשרף הטעון.

בועה N2 גז דרך תערובת שרף במשך 30 דקות, ולאחר מכן לנקז את הממס. לשטוף ולנקז את החרוזים עם 10 מ"ל מנות של DMF שלוש פעמים, כמו קודם.

חזור על מבחן הקייזר. צימוד התרחש בהצלחה אם החרוזים והפתרון הופכים לצהובים, מה שמצביע על כך שאין קבוצות אמין.

לאחר מכן, לבקע את קבוצת Fmoc החדשה עם 20% 4-מתילפיפרידין ב- DMF ולשטוף את החרוזים עם 10 מ"ל מנות של DMF. חזור על צימוד והגנה עבור כל חומצת אמינו שנותרה בפפטיד היעד.

לאחר שחומצת האמינו האחרונה עברה הגנה וחרוזי השרף נשטפו, הוסיפו 40 מ"ל של תמיסת מחשוף פפטיד כדי להפריד את מוצר הפפטיד מהשרף.

גז חנקן בועה דרך תערובת שרף במשך 3 שעות, ולאחר מכן להחליף את הבקבוקון המקבל. מעבירים את הפתרון מתערובת השרף לבקבוקון המקבל החדש תחת ואקום.

כדי ליצור את המוצר הסופי, להסיר את הממס עם מאידה סיבובי.

סינתזת פאזה מוצקה נמצאת בשימוש נרחב בביולוגיה ובכימיה. בואו נסתכל על כמה דוגמאות.

סינתזה פאזית פתחה מסלולים סינתטיים חדשים רבים לאוליגוסכרידים, שהם שרשראות קצרות של מונומרים פשוטים של סוכר עם תפקידים ביולוגיים חשובים, כגון אחסון אנרגיה. שלא כמו קשרים פפטידים, כל קשר בין סוכרים מכיל סטריאו-סנטר. כדי לסנתז אוליגוסכריד, לא רק שהמונומרים חייבים להיות בסדר הנכון, אלא שהקשרים חייבים להיות גם הסטריאוטיפים הנכונים. טכניקות סינתזה שלב מוצק פותחו כדי לזווג כל מונומר על ידי תהליך סטריאו-סלקטיבי מאוד, אשר היום הוא מעודן מספיק כדי להיות אוטומטי.

סינתזה שלב מוצק היא גישה נפוצה לכימיה קומבינטורית, שהיא הנוהג של סינתזה של גרסאות רבות של תרכובת בתהליך סינתטי אחד. שרף טעון ניתן לפצל בקלות לחלקים להגיב עם מונומרים שונים או מולקולות. לאחר כל תגובה, המנות נשטפות ומתאחדות מחדש. פעולה זו חוזרת על עצמה עד שנוצר מספר המוצרים הרצוי. טכניקה זו שימושית במיוחד במחקר פרמצבטי, שכן ניתן להשתמש בה כדי ליצור תרכובות חדשות או להעריך את התגובה של תרכובת עם מגוון רחב של מולקולות.

הרגע צפית בהקדמה של ג'וב לסינתזת פאזה מוצקה. עכשיו אתה צריך להבין את העקרונות הבסיסיים של סינתזת פאזה מוצקה, ההליך עבור סינתזת פפטיד שלב מוצק, וכמה דוגמאות של איך סינתזת פאזה מוצקה משמשת בכימיה אורגנית. תודה שצפיתם!

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Results

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

תוצאות מייצגות עבור סינתזת פפטיד שלב מוצק עבור הליך 3.

שלב הליך צבע הפתרון
3.1 בקרה - בהיר וצהוב בהיר
תגובה – ברור, צהוב בהיר
3.2 בקרה - בהיר וצהוב בהיר
תגובה – כחול כהה
3.3 פתרון כחול כהה, חרוזים כחולים – הגנה מלאה או צימוד נכשלו
חסר צבע, חרוזים צהובים – הסרת ההגנה נכשלה או השלמת ההשלמה
פתרון חסר צבע, חרוזים אדומים – צימוד לא שלם או הגנה לא שלמה

טבלה 1. תוצאות מייצגות עבור Procedure 3.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Applications and Summary

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

בניסוי זה, הדגמנו דוגמה של סינתזה שלב מוצק באמצעות SPPS באמצעות סינתזה של dipeptide.

סינתזה שלב מוצק נמצא בשימוש נרחב בכימיה קומבינטורית לבנות ספריות של תרכובות להקרנה מהירה. זה היה נפוץ לסנתז פפטידים, אוליגוסכרידים, וחומצות גרעין. יתר על כן, מושג זה יושם בסינתזה כימית. מכיוון שהוא הטרוגני, ריאגנטים אלה הנתמכים על ידי מוצק לעתים קרובות ניתן למחזר ונעשה בהם שימוש חוזר בתגובות הבאות.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Transcript

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the English version.

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter