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Organic Chemistry II

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고체 위상 합성

Overview

출처: 비 M. 동과 다이앤 르, 캘리포니아 대학, 어바인, 캘리포니아 화학학과

메리필드의 고체 상 합성은 반응성 분자가 고체 지지에 묶여 있고 원하는 화합물을 형성하기 위해 연속적인 화학 반응을 겪는 노벨상 수상 발명품입니다. 분자가 고체 지지체에 묶여있을 때, 과잉 시약 및 부산물은 불순물을 씻어서 제거 할 수 있으며, 표적 화합물은 수지에 묶여 있습니다. 구체적으로, 우리는 이 개념을 보여주기 위하여 고체 상 펩티드 합성 (SPPS)의 예를 선보일 것입니다.

Principles

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고체 상 합성은 분자의 합성을 간소화하는 데 사용되는 방법입니다. 그것은 종종 결합 화학 (시간의 짧은 기간에 분자의 많은 수를 준비하는 데 사용되는 기술), 정화의 용이성으로 인해 화합물의 라이브러리를 생성하는 데 사용되는, 전반적인 화학 합성. 고체 상 합성은 전형적으로 수지의 사용을 포함; 비용해성 폴리머 계열 소재로, 사전 기능화되어 시작 건물 블록이 쉽게 결합할 수 있다. 빌딩 블록은 일반적으로 수지에 추가되면 보호되며, 용액(그림1)에서원하는 빌딩 블록으로 쉽게 보호 해제및 처리될 수 있다. 원하는 분자가 합성되면 수지에서 쉽게 갈라질 수 있습니다.

견고하기 때문에, 고체 상 합성은 핵산, 올리고당, 그리고 가장 일반적으로 펩타이드를 합성하는 데 사용되어 왔다. 1963년 로버트 브루스 메리필드에 의해 발견되고 보고된 SPPS는 펩티드 라이브러리를 생성하는 가장 널리 사용되는 방법이 되었습니다. 메리필드는 1984년 SPPS 발명으로 노벨상을 수상했다. SPPS는 쉽게 Fmoc (염기 민감성) 또는 Boc (산 에 민감한)N-아미노산에 대한 보호 그룹을 활용하여 짧은 시간에 펩티드 라이브러리를 구축할 수 있습니다. HBTU (커플링 제) 및 i-Pr2EtN(base)은 다른 아미노산과 결합하기 위한 아미노산의 C-종산을활성화한다. Fmoc 보호 그룹은 4-메틸피프리딘에 의해 제거될 수 있으며, Boc 보호 그룹은 트리플루오로아세트산과 같은 강한 산에 의해 제거될 수 있다. 이 실험에서는 디펩타이드의 합성을 통해 SPPS를 시연할 것입니다. 우리는 카이저 테스트를 사용할 것입니다, 기본 아민의 존재를 테스트하는 질적 방법, 반응의 진행 상황을 모니터링.

Figure 1
그림 1. 고체 상 펩티드 합성(SPPS)의 개념.

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Procedure

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1. 수지로드

  1. 100mL 펩타이드 합성 용기에 2-클로로트리틸 염화물(CTC) 수지(1.1mmol/g, 0.360 g, 0.400 mmol)를 첨가한다. 20mL DMF를 추가하고 N 2에서 30 분 동안 팽창 할 수있습니다.
  2. 진공 상태에서 구슬을 빼내고 10mL DMF를 추가합니다.
  3. 500 mg Fmoc-Ala-OH (1.60 mmol)와 2.5 mL i-Pr2EtN을 추가하고 N2에서 15 분 동안 혼합하십시오.
  4. 용매를 진공 상태에서 배출하고 Fmoc-Ala-OH로 15분 동안 적재를 반복합니다.
  5. 용매를 진공 상태에서 배출하고 10mL DMFunder N2로구슬을 세척하고 진공 3배 하에서 배수합니다.

2. Fmoc 그룹의 보호 해제

  1. DMF에 10mL 20% 4메틸피프리딘을 넣고 15분 동안 N2 아래에서 구슬을 저어줍니다.
  2. 용매를 진공 상태에서 배출하고 보호 해제를 반복합니다.
  3. 구슬을 N2에서 10mL DMF로 세척하고 진공 3배 이하로 배수합니다.

3. 카이저 테스트 수행

  1. 솔루션 A(0.5mL 0.01 M KCN, 24.5mL 피리딘), 솔루션 B(닌히드린 1g, 20mL n-부타놀), 용액 C(20g 페놀, 10mL n-butanol)를각각 2개의 시험튜브에 추가하여 카이저 테스트를 수행한다. 한 개의 테스트 튜브는 대조군이 될 것이고 다른 하나는 반응을 모니터링합니다.
  2. 반응 시험관으로부터 수지의 구슬을 몇 개 추가하고 두 개의 시험관을 110°C로 가열한다.
  3. 보호 가 완료되면 테스트 튜브의 내용이 진한 파란색 / 보라색 으로 바뀝니다. 보호 해제가 완료되지 않았거나 실패하면 솔루션은 노란색으로 유지됩니다. 반응 테스트 튜브를 제어 테스트 튜브와 비교합니다.

4. 다음 빌딩 블록 커플링

  1. 진공 상태에서 용매를 배출합니다.
  2. 구슬을 N-메틸-2-피롤리돈 10mL로세척하고 진공 상태에서 용매를 배출한다.
  3. 다음 커플링을 시작하려면 10mL NMP, 620 mgFmoc-Phe-OH (1.6 mmol), 610 mg HBTU (1.6 mmol), 2.5 mLi-Pr2EtN을 추가하고 수지N2 에서 30 분 동안 거품을 허용하십시오.
  4. 진공 상태에서 용매를 배출합니다.
  5. 구슬을 N2에서 10mL DMF로 세척하고 진공 3배 이하로 배수합니다.
  6. 카이저 테스트를 수행 (단계 3.1-3.3 참조) 커플링의 완료를 찾습니다. 테스트 튜브의 구슬과 용액은 노란색이어야 합니다.

5. 수지에서 펩타이드를 찢어

  1. 2.1-2.3 단계를 사용하여 나머지 Fmoc 그룹을 클리크합니다.
  2. 용매가 진공 상태에서 배수된 후 N 2 에서 수지 및 버블에 40 mL 절단 용액(95% TFA, 2.5% H2O, 2.5% TIPS)을 추가하여N2에서 3h로 기포합니다.
  3. 펩티드 신디사이저에 새로운 수신 플라스크를 놓고 진공 하에서 원하는 펩티드를 포함하는 TFA 용액을 새로운 플라스크에 배출한다.

6. 펩타이드의 강수량과 나는 고양

  1. TFA 용액을 4원추형 바이알로 분리하고 각 유리병에 25mL 콜드 에테르(−20°C)를 추가하여 펩티드를 침전시한다.
  2. 20 분 동안 바이알 (3,000 rpm, 0-4 °C)을 원심 분리합니다. 원뿔 바이알에서 남은 TFA 및 에테르 용액을 데산하고 펩티드 침전물을 농축하여 원하는 디펩티드를 백색 고체로서 감당할 수 있다.

고체 상 합성은 용해성 물질에 묶여있는 동안 제품을 합성하는 방법입니다.

고체 상 합성은 펩티드, 핵산 및 올리고당과 같은 생물학적 올리고머 및 폴리머를 생산하는 데 종종 사용됩니다. 이 분자는 단량제에게 불린 더 작은 분자 서브유닛의 사슬로 이루어지고 있습니다. 단량체를 올바른 순서로 추가해야 하므로 올리고머 또는 폴리머를 합성하는 데는 여러 단계가 필요합니다.

다단계 신디사이저의 문제점은 중간 제품이라고불리는 각 단계의 안정적인 제품의 정제 및 격리가 전체 수율을 감소시키는 것입니다. 고체 상 합성에서 중간 제품은 합성 을 통해 고체 지지에 묶여 있습니다. 이를 통해 솔루션 상 시약, 용매 및 부산물을 세척할 수 있으므로 각 중간 제품을 단계 간에 정화하고 격리할 필요가 없습니다.

이 비디오는 고체 상 펩티드 합성을 위한 절차를 설명하고 화학에 있는 고체 상 합성의 몇몇 응용을 소개할 것입니다.

고체 상 합성에서 분자는 반응의 순서에서 고체 지지체에 합성됩니다. 예를 들어, 올리고머 또는 폴리머는 최종 제품을 형성하기 위해 한 번에 하나의 단조량체를 합성합니다. 성장하는 올리고머 또는 폴리머는 시약과의 지지에서 분리또는 갈라지때까지고체 지지에 강하게 묶여 있습니다.

각 단조량은 폴리머 체인의 일부로 적어도 두 개의 결합 부위가 있어야 하지만 단조가 올바른 원자에 결합되도록 한 번에 하나의 바인딩 사이트만 사용할 수 있습니다. 이것은 합성의 하나 이상의 단계 도중 반응하지 않는 기능 성 단인 보호 단으로달성됩니다. 결합 부위는 분자를 특정 시약으로 처리하여 보호 그룹을 반응성 기능 그룹으로 변환함으로써 복원되거나 보호해제됩니다.

고체 상 합성을 시작하기 위해, 시작 재료는 유일하게 사용 가능한 결합 부위에 특별히 설계된 수지 또는 용해성 폴리머에 묶여 있다. 그런 다음, 바운드 시작 재료는 체인에서 두 번째 단조량의 결합을 허용하도록 보호 해제됩니다. 다음으로, 단량체 간의 결합을 용이하게 하기 위해 결합 제과 함께 체인내의 두 번째 단조량의 솔루션이 추가됩니다.

두 번째 단조량체가 시작 재료에 결합되면, 생성된 희미한 중간 생성물은 보호해제됩니다. 이 과정은 표적 올리고머 또는 폴리머가 형성될 때까지 반복된다. 이 제품은 고체 지지대에서 정제, 격리 및 분석할 수 있는 솔루션으로 갈라집니다.

고체 상 합성은 종종 아미노산의 체인인 펩티드의 합성에 사용됩니다. 아미노산은 아민 군, 카복실 그룹, 대체, 또는 '사이드 체인'을 가지고 있습니다. 아민은 처음에 보호됩니다. 일단 보호해제되면, 아민은 다음 아미노산의 카복틸 그룹과 펩티드 결합을 형성한다.

이제 고체 상 합성의 원리를 이해하게 되었으므로, 고체 상 펩티드 합성을 위한 절차를 거치도록 합시다.

시술을 시작하려면, 100mL 수동 펩타이드 합성 용기에 폐기물수신 플라스크를 연결한다. 그런 다음 2 클로로트리틸 염화물 수지 0.360 g을 용기에 넣습니다. 질소 가스 라인을 선박 사이드암에 연결하고 진공 선을 톱니 모양의 호스 어댑터에 연결합니다.

수지에 20mL의 디메틸포르마미드를 추가하고 수지 구슬이 질소 가스의 흐름 하에서 30분 동안 팽창할 수 있도록 합니다. 그런 다음 진공을 적용하여 용매를 배출합니다.

DMF 10mL, Fmoc 보호 아미노산 1.6mmol, N,N-이소프로틸레틸레틴 2.5mL를 용기에 넣습니다. 용액을 혼합하는 질소 가스 아래의 거품은 보호된 아미노산을 수지에 15분 동안 적재합니다.

진공 상태에서 용매를 제거하고 두 번째 로딩을 수행합니다. 용매를 제거한 후, DMF의 10mL 부분에서 적재된 수지 비드를 세 번 교반하여 각 세척을 수신 플라스크로 배출한다.

다음으로, DMF에서 4-메틸피프리딘의 20% 용액의 로드된 구슬 10mL에 추가한다. Fmoc 그룹을 제거하기 위해 15 분 동안 혼합물을 거품.

용매를 빼내고 보호 방지 절차를 반복하십시오. 전과 같이 로드된 수지세를 세 번 씻고 빼내십시오. 다음 단계에 대비할 때까지 구슬을 용매 아래에 저장합니다.

로드된 화합물이 완전히 보호 해제되었는지 확인하기 위해 두 개의 테스트 튜브에서 각 Kaiser 테스트 솔루션의 1~2방울을 제거합니다.

테스트 튜브에 적재된 구슬을 몇 개 놓고 두 튜브를 오일 욕조에 110도로 가열합니다. 수지 혼합물이 진한 파란색에서 보라색으로 변하면 보호가 완료되어 혼합물에 아민 그룹의 존재를 나타냅니다.

커플링 단계를 시작하려면 먼저 N2 가스의 흐름하에서 10mL의 NMP로 구슬을 세척하십시오.

이어서, NMP 10mL, 다음 Fmoc 보호 아미노산의 1.6mmol, 커플링 에이전트 HBTU의 1.6 mmol, 및 2.5 mL의 DIPEA를 로드된 수지에 추가한다.

30 분 동안 수지 혼합물을 통해 N2 가스를 거품 한 다음 용매를 배출하십시오. 이전과 마찬가지로 DMF의 10mL 부분으로 구슬을 세번 세척하고 배출하십시오.

카이저 테스트를 반복합니다. 구슬과 용액이 노란색으로 바뀌면 결합이 성공적으로 발생하여 아민 그룹이 존재하지 않는다는 것을 나타냅니다.

다음으로, DMF에서 20% 4메틸피프리딘으로 새로운 Fmoc 그룹을 갈라내고 DMF의 10mL 부분으로 구슬을 씻는다. 표적 펩타이드에서 남은 각 아미노산에 대한 커플링 및 보호 해제를 반복한다.

마지막 아미노산이 보호해제되고 수지 비드가 세척된 후 펩타이드 골짜기 용액40mL를 추가하여 펩티드 제품을 수지로부터 분리한다.

3 시간 동안 수지 혼합물을 통해 질소 가스를 거품한 다음 수신 플라스크를 교체하십시오. 수지 혼합물에서 진공 상태에서 새로운 수신 플라스크로 용액을 전달합니다.

최종 생성물을 생성하려면 회전 증발기로 용매를 제거합니다.

고체 상 합성은 생물학과 화학에 널리 사용됩니다. 몇 가지 예를 살펴보겠습니다.

고체 상 합성은 에너지 저장과 같은 중요한 생물학적 역할을 가진 간단한 설탕 단량제의 짧은 사슬인 올리고당오리에 많은 새로운 합성 통로를 열었습니다. 펩티드 결합과는 달리 설탕 간의 각 결합에는 스테레오 센터가 포함되어 있습니다. 올리고자카라이드를 합성하려면 단조가 올바른 순서에 있어야 할 뿐만 아니라 채권도 올바른 입체화학을 가져야 합니다. 고체 상 합성 기술은 오늘날 자동화될 수 있을 정도면 충분히 정제된 매우 스테레오선택적 공정에 의해 각 단조량에 결합하도록 개발되었습니다.

고체 상 합성은 결합 화학에대한 일반적인 접근법이며, 이는 단일 합성 과정에서 화합물의 많은 변종을 합성하는 관행입니다. 로드된 수지는 다른 단량체 또는 분자와 반응하기 위해 부분으로 쉽게 분할될 수 있습니다. 각 반응 후, 부분은 세척및 재결합된다. 이는 원하는 제품 수가 생성될 때까지 반복됩니다. 이 기술은 제약 연구에서 특히 유용, 그것은 새로운 화합물을 생성 하거나 분자의 넓은 배열 화합물의 반응성을 평가 하는 데 사용할 수 있습니다.

당신은 단지 고체 위상 합성에 JoVE의 소개를 보았다. 이제 고체 상 합성의 기본 원리, 고체 상 펩티드 합성 절차 및 유기 화학에서 고체 상 합성이 사용되는 방법의 몇 가지 예를 이해해야합니다. 시청해 주셔서 감사합니다!

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Results

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고체 상 펩티드 합성에 대한 대표적인 결과 3.

절차 단계 솔루션의 색상
3.1 컨트롤 - 클리어, 라이트 옐로우
반응 – 맑고 밝은 노란색
3.2 컨트롤 - 클리어, 라이트 옐로우
반응 – 다크 블루
3.3 다크 블루 솔루션, 구슬 블루 – 완전한 보호 또는 커플링 실패
무색, 구슬 노란색 - 보호 에 실패하거나 완료 완료
무색 솔루션, 구슬 레드 – 불완전한 커플링 또는 불완전한 보호 해제

표 1. P로쉐르 3의 대표적인 결과.

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Applications and Summary

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본 실험에서, 우리는 디펩티드의 합성을 통해 SPPS를 통한 고체상 합성의 예를 입증하였다.

고체 상 합성은 빠른 스크리닝을 위한 화합물라이브러리를 구축하기 위해 결합 화학에 널리 사용된다. 그것은 일반적으로 펩 티 드를 합성 하는 데 사용 되었습니다., 올리고당, 그리고 핵 산. 더욱이, 이 개념은 화학 합성에서 구현되었습니다. 이기때문에, 이러한 고체 지원 시약은 종종 재활용 및 후속 반응에서 재사용할 수 있습니다.

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