Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Science Education
Biomedical Engineering

A subscription to JoVE is required to view this content.
You will only be able to see the first 20 seconds.

הדמיה דגימות ביולוגיות עם מיקרוסקופיה אופטית וקונפוקל
 
Click here for the English version

הדמיה דגימות ביולוגיות עם מיקרוסקופיה אופטית וקונפוקל

Overview

מקור: פיימן שהביגי-רודפושטי וסינה שהבזמהאמדי, המחלקה להנדסה ביו-רפואית, אוניברסיטת קונטיקט, סטוררס, קונטיקט

מיקרוסקופים אופטיים קיימים כבר מאות שנים, ובעוד הם הגיעו למגבלה התיאורטית שלהם של רזולוציה לפני עשרות שנים, ציוד וטכניקות חדשות, כגון עיבוד תמונה קונפוקלית ודיגיטלית, יצרו נישות חדשות בתחום ההדמיה האופטית. המיקרוסקופים האופטיים הטובים ביותר יהיו בדרך כלל רזולוציה עד 200 ננומטר בתנאים אידיאליים. עם זאת, מיקרוסקופים אופטיים מוגבלים על ידי עקיפה של גלים, פונקציה של אורך הגל, שהוא סביב 500 ננומטר עבור אור גלוי. בעוד שהרזולוציה של מיקרוסקופים אופטיים אינה מגיעה לזה של מיקרוסקופי אלקטרונים, הם הכלים החשובים ביותר בהדמיה של מבני מאקרו ביולוגיים והם מרכיב עיקרי בכל מעבדה ביולוגית.

במיקרוסקופי אור קונבנציונליים, האות המופק מהאובייקט המצופה הוא מעובי מלא של הדגימה, אשר אינו מאפשר לרובו להיות בפוקוס לצופה. זה גורם לתמונה להיות "מחוץ לפוקוס טשטוש". המיקרוסקופ הקונפוקללי, לעומת זאת, מאיר את הדגימה דרך חור סיכה, ולכן הוא מסוגל לסנן את האור מחוץ לפוקוס מלמעלה ומתחת לנקודת המיקוד באובייקט.

הדגמה זו מספקת מבוא לרכישת תמונות בשיטות מיקרוסקופיה אופטית וקונפוקל. כאן, חתיכה חלקית של מוח העכבר תיחקר.  רכישת תמונה וניתוח, כולל הכלים ליצירת מפות טופוגרפיות ותמונות מורכבות, יכוסו. היתרונות והחסרונות של שיטות הדמיה שונות בכל הנוגע לרזולוציה, עומק המיקוד וסוג המדגם יידונו גם הם. מטרת הדגמה זו היא לספק מידע נוסף על מיקרוסקופים אופטיים וקונפוקל כדי לקבוע אם מודולי מיקרוסקופיה אלה מתאימים ביותר לסוג של מדגם ביולוגי.

Principles

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

מיקרוסקופים אופטיים פועלים באמצעות לפחות שני אלמנטים של הגדלה. העדשה הראשית, הנקראת המטרה, קובעת את ההגדלה הכוללת, והעדשה המשנית, הנקראת העין, ממקדת את התמונה הווירטואלית לצפייה. ההגדלה הכוללת נקבעת על ידי הכפלת ההגדלות של שתי העדשות. מיקוד האור דרך מקורות אלה, יחד עם מיקוד האור מהמנורה אל המדגם, נותנים מישור מסוים של מיקוד שבו ההגדלה ואור המנורה נפגשים כולם באותה נקודה, המעניקה את הרזולוציה הטובה ביותר בתמונה. הדמות שלהלן מדגימה כיצד מישור המוקד של הדגימה נוצר דרך העדשות השונות. לחפצים מחוץ למישור המוקד יהיו קרני אור המפריעות מחלקים אחרים של הדגימה בשל שטח התאורה הגדול יותר. פעולה זו גורמת לטשטוש בתמונה. לכן, כדי להתמקד במיקומי z שונים של מדגם עם גבהים שונים במידה רבה, פרוסות כיוון z חייבות להיות מועברות לתוך מישור המוקד.

Figure 1
איור 1. עדשות מיקרוסקופיה אופטיות ומישורי מוקד.

מיקרוסקופים דיגיטליים פועלים על אותו עיקרון כמו מיקרוסקופים אופטיים, אלא שהם אינם מסתמכים על עין. זה מיקרוסקופ אופטי המצויד במצלמה דיגיטלית. המצלמה הדיגיטלית פועלת כגלאי, ותמונות מוצגות על צג מחשב. מיקרוסקופים אלה אידיאליים לניתוח ותיעוד של דגימות במהלך מחקר ופיתוח (מו"פ), ייצור ובדיקה, בקרת איכות וביטחון (QC/QA), כמו גם ניתוח כשלים (FA). הם בדרך כלל מציעים תוכנה המאפשרת למשתמשים לנתח את התמונה לדוגמה. איור 2 מציג הגדרת מיקרוסקופ דיגיטלי טיפוסית.

Figure 2
איור 2. המרכיבים העיקריים של מיקרוסקופ דיגיטלי.

המרכיבים העיקריים של המערכת הם:

  1. מנוע אופטי: מכיל את חיישן רכישת התמונה ואת העדשות להגדלה בתמונה.
  2. מטרה: רוכש וממקד את האור מהדגימה. שלוש מטרות שונות זמינות עבור משימות שונות לרכישת תמונות.
  3. שלב הסריקה: מיקום המיקום שבו יש למקם את הדגימה.
  4. מעמד מיקרוסקופ: מספק את התמיכה עבור המנוע האופטי ושלב הסריקה. שולט גם בתקשורת בין הרכיבים המצורפים לבין המחשב.
  5. מחשב: תומך בתוכנת משתמש ומאפשר הצגה של תמונות בצג.
  6. בקר: שולט במיקרוסקופ ובזרימת העבודה באמצעות מחוות מרובות מגע וסמלים רגישים להקשר. ידיות הבקרה שולטות במיקום תמונת הזום, המוקד והמיקרוסקופ.

מיקרוסקופ קונפוקלי, או מיקרוסקופ סריקת לייזר קונפוקלי (CLSM), הוא מיקרוסקופ עם רזולוציה אופטית מוגברת וניגודיות. קונפוקל פירושו "בעל אותו המיקוד". האובייקט ודמותו הם "קונפוקליים".

Figure 3
איור 3. טשטוש והשפעתה על תמונה. התמונה השמאלית מציגה תמונת מיקוד עם קצוות מטושטשים. התמונה הנכונה מדגימה את נתיב האור דרך העדשה בעת הדמיה של דגימה שנמצאת במוקד.

בניגוד למיקרוסקופי אור כלליים המאירים ומציתים את המדגם כולו בתצוגה, מיקרוסקופים קונפוקליים משתמשים בחור סיכה בין שלב הדגימה לגלאי, כך שרק קרן אור קטנה יותר ממוקדת ברמת עומק צרה אחת בכל פעם. לפיכך, האזור הגלוי היחיד של המדגם הוא נקודת המוקד. המיקרוסקופ הקונפוקל אז רסטר סורק את פני השטח של המדגם עם זה הרבה יותר ממוקד של אור (או לייזר). לאחר מכן הנתונים מורכבים לתמונה 2D אחת עם רזולוציה טובה יותר מאשר מיקרוסקופיה אופטית קלאסית. כמו כן, מכיוון שהאור מתמקד בטווח גבהים צר מאוד, המשתמש יכול לשים מישורים שונים בפוקוס כאשר כיוון Z מועבר. באמצעות טכניקות עיבוד תמונה ומיקרוסקופים קונפוקליים של תוכנות אוטומציה מסייעים בשחזור תלת-ממדי של תמונות מרוכבים ממוקדות מרובות מישורים.

למיקרוסקופים קונפוקליים יש את היכולת באמצעות עיבוד תמונה לתת נתוני כיוון Z על מדגם שבעבר לא היה זמין במיקרוסקופיה אופטית. לדוגמה, בהדגמה המתוארת להלן, המשתמש יכול להגדיר את הטווחים העליונים והתחתונים של המוקד עבור מדגם, ולאחר מכן לא רק לפתח מפת חום המציגה מדידות של כיוון z, אלא גם ליצור תמונה מורכבת המציגה את כל חלקי התמונה במוקד. תכונות אלה שימושיות במיוחד בעת קבלת נתונים תלת-ממדיים אודות דוגמה.

Figure 4
איור 4. המרכיבים העיקריים של מיקרוסקופ קונפוקלי.

המרכיבים העיקריים של המיקרוסקופ הקונפוקלי כוללים:

  1. סרוק את הראש עם כונן Z משובח ומצלמת 4 מגה פיקסל, עומד עם כונן Z גס
  2. מטרות: 2.5x / 5x / 10x / 20x / 50x / 100x
  3. שלבים: שלב סריקה ושלב קבוע
  4. מערכת מחשב: תוכנת הדמיית מערכת מחשב
  5. בקר: x, Y, תנועת z

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Procedure

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

1. הדמיה קונפוקלית

  1. טען את הדגימה על הבמה. מרכז אותו מתחת לעדשה. זה לא יעלה על מגבלת המשקל של השלב, אשר במקרה זה הוא 5 ק"ג. המדגם לא צריך להיות יותר מ 100 מ"מ עובי.
  2. פתח את תוכנת ההדמיה ובחר "צור משימה".
  3. תחת העמודה טופוגרפיות, בחר בלחצן המסייע.
  4. צור תמונת מבט כוללת בהגדלה הנמוכה ביותר, פי 2.5. לפני החלפת ההגדלות, ודא שהדגימה נמצאת במוקד על-ידי שינוי מיקום Z עד שתראה תמונה ברורה. זה יכול להיעשות על ידי דחיפה למטה או משיכה על מניפולטור מיקרוסקופ 3D. תנועת Z עדינה יותר מושגת על-ידי עיסוק בכפתור בצד, מה שגורם לאור כחול סביב הקצוות.
  5. הגדל לאט את הגדלת העדשה, משחק ברציפות עם עוצמת האור ואת המוקד עד שאתה בהגדלה הרצויה. אם תרצה, בחר אזור עניין אחר על-ידי הזזת הבמה בכיווני x ו- y באמצעות המניפולטור.
  6. לאחר שתמונת מבט כולל נלקחת בהגדלה הנמוכה, לחץ על הלחצן הבא כדי להמשיך לשלב נקודת ההתייחסות. אם תרצה, ציין נקודת התייחסות מסוימת לצורך מדידה (כלומר, פינת המדגם), אם כי לשם כך נקודת ההתייחסות המוגדרת כברירת מחדל היא בסדר.
  7. הקש על החץ הבא כדי להמשיך לחלק הבא של האשף.
  8. שנה את המטרה כרצונך כדי לראות פתרון המתאים לדגימה שלך. במקרה זה, העדשה האובייקטיבית 50X משמשת להדמיה של התאים במדגם. ה- 50X היא העדשה הקרובה ביותר לדגימה, ולכן עברו בהדרגה ליעד 50X המבטיחים שעדיין יש מקום להקטין את מרחק העבודה לאחר עדשת 20X.
  9. בדף "הגדרת טווח מדידה", הזז מעט את מיקום Z (לחיצה על לחצן הצד במניפולטור להתאמות עדינות) כך שרק החלק העליון של המדגם נמצא בפוקוס ולחץ על "הגדר אחרון". לאחר מכן הזז את השלב בכיוון Z (כלפי מטה) עד שרק החלק התחתון של המדגם נמצא במוקד ולחץ על "קבע ראשון". ודא שמספר הפרוסות המחושב אינו עולה על 1000 או שהתוכנית תיכשל.
  10. ודא שעוצמת האור אינה רוויה יתר על המידה (לגרום לפיקסלים אדומים) בתמונה בכל אחת מההקלות ולאחר מכן תבוצע. פעולה זו תיקח את תמונת הטומוגרפיה ותפתח את תוכנת הטומוגרפיה.
  11. בתוכנת טומוגרפיה, פתח כרטיסיות כגון הכרטיסיה Studies כדי להציג את הנתונים בתלת-ממד ולנקוט מדידות בשטח 2D או תלת-ממדי.

2. הדמיית מיקרוסקופ אופטי דיגיטלי

  1. טען את הדגימה על הבמה. מרכז את הדגימה מתחת לעדשה. משקל המדגם לא יעלה על מגבלת המשקל של השלב, אשר במקרה זה הוא 4 ק"ג. המדגם צריך להיות לא יותר מ 12 ס"מ.
  2. פתח את תוכנת ההדמיה.
  3. בחר משימה מרשימת התבניות שסופקו. אפשר גם לעבוד מחוץ לעבודה על ידי לחיצה על בדיקה חופשית, המאפשרת לך ללמוד מדגם מחוץ לעבודה.
  4. השג תמונת מבט כולל המציגה את כל הבמה. פעולה זו תשמש כמפה בהמשך כדי להציג את החלק של המדגם הנצפה. בעת רכישת התמונה, השתמש בבקר כדי לשנות את המוקד ואת מיקום התמונה.
  5. מקם מערכת קואורדינטות. מערכת הקואורדינטות המוגדרת כברירת מחדל היא מהפינה האחורית-שמאלית של הבמה והיא בסדר עבור יישום זה. אם המדגם עקום, אתה יכול להתאים את הקואורדינטות כאן.
  6. תן שם לדוגמה ולמשימה, פעולה זו מוסיפה אותה לרשימת המשימות כך שמשתמשים אחרים יוכלו לחזור אליה.
  7. בחר בלחצן המצלמה תחת רכוש. קח תמונה ראשונית ולאחר מכן לחץ על לחצן חי בעת ניווט בדוגמה.
  8. הזז את המוקד כלפי מטה עד שהדגימה נמצאת בבירור במוקד. ייתכן שיהיה צורך גם להתאים את התאורה תחת לשונית תאורה וצמצם".
  9. מטב את התמונה בעזרת הכלים מתחת לחלוני 'מיטוב תמונה'. ניתן לשחק עם פרמטרים שונים תחת הכרטיסיה 'שיפורי תמונה', כגון הטיית העדשה, רמות התאורה במדגם, הבהירות וניגודיות, עד שהתמונה תקבל את החדות הרצויה.
  10. בצע מדידות על-ידי הקשה על הכלי Pencil בתוכנה. משם, יש לך גישה למספר כלי מדידה, כולל מרחקים, זוויות ואזור. השתמש בכלי המרחק והאזור כדי למדוד את גודל המדגם.
  11. עבור לכרטיסיה זרימת עבודה של תוצאות ובדוק את פריסת זרימת העבודה כדי לקבוע את תצורת הפריסה של הדוח
  12. הקש על לחצן השמירה כדי לשמור את המשימה שלך כדי שאחרים יוכלו להשתמש באותה זרימת עבודה.

מיקרוסקופיה היא שיטה הנמצאת בשימוש נרחב כדי לדמיין את המבנה המפורט של דגימות. מיקרוסקופים אופטיים, הממקדים אור דרך סדרה של עדשות כדי להגדיל דגימות, היו בשימוש במשך מאות שנים עם המיקרוסקופ המורכב הראשון שהופיע במאה ה -17. במהלך תקופה זו, אנטוני ואן Leeuwenhoek היה הראשון להתבונן חיידקים, שמרים, תאי דם אדומים, במחזור בכלי נימי, תרומה מדעית משמעותית וסלול את הדרך להתקדמות מיקרוסקופית.

מיקרוסקופים אופטיים עדיין נמצאים בשימוש נרחב כיום במחקר ובהגדרות קליניות לאבחון רפואי. עם זאת, ב -60 השנים האחרונות, מיקרוסקופיה קונפוקלית הופיע אשר מאיר את המדגם דרך חור סיכה כדי להגדיל את הרזולוציה האופטית וניגודיות.

וידאו זה ימחיש את עקרונות ההפעלה של מיקרוסקופיה אופטית וקונפוקלית, ידגים כיצד מנתחים תמונות ברזולוציה גבוהה, וידון במספר יישומים של מיקרוסקופיה בתחום ההנדסה הביו-רפואית.

הבה נתחיל בדיון ביסודות המיקרוסקופיה הקונפוקלית. מיקרוסקופיה אופטית מבוססת על העיקרון של מיקוד האור על מדגם כדי לדמיין את המבנה המפורט שלו. מיקרוסקופ נוצר משני רכיבי הגדלה; העדשה האובייקטיבית, הממקדת תמונה אמיתית של אובייקט, והעין, הממקדת תמונה וירטואלית מוגדלת לפני שהיא מתקבלת על ידי העין. ההגדלה הכוללת מושגת על ידי הכפלת ההגדלות של שתי עדשות אלה.

מיקוד האור מעניק מישור מיקוד מסוים שבו ההגדלה ואור המנורה נפגשים כולם באותה נקודה, המעניקה את הרזולוציה הטובה ביותר בתמונה. כאשר מחוץ למישור המוקד, אזור התאורה גדול יותר וקורות אור מפריעות לחלקים אחרים של המדגם, וגורמות לתמונה להיות מטושטשת. כאשר מיקרוסקופים קלים מאירים ומציתים את המדגם כולו בתצוגה, מיקרוסקופ קונפוקלי משתמש בחור סיכה בין שלב הדגימה לגלאי, כך שרק קרן אור קטנה ממוקדת בעומק צר אחד בכל פעם.

כתוצאה מכך, האזור הגלוי היחיד של המדגם, הוא נקודת המוקד, המספקת תמונה שנפתרה היטב. עם זאת, ברזולוציה גבוהה יותר, רק חלק קטן מדגם זה מוצג בכל פעם. על ידי הזזת הדגימה במישור X-Y, ניתן לבצע סריקת רסטר של פני השטח שלו. עבור כל נקודה בסריקה, המוקד ממוטב על-ידי התאמת גובה ה- Z כדי לגשת למישורי מוקד שונים. פעולה זו מבטיחה רזולוציה מרבית נקודה אחר נקודה של דוגמה לתמונה.

עכשיו בואו נשתמש בעקרונות אלה של מיקרוסקופיה ורזולוציית תמונה כדי לדמיין מוח עכבר באמצעות מיקרוסקופ קונפוקלי, ואופטי.

לאחר שבדקנו את העקרונות העיקריים של מיקרוסקופיה, בואו נבצע כעת מדידה באמצעות מיקרוסקופ קונפוקלי. ראשית, הפעל את המיקרוסקופ בתחנת העבודה של המחשב. לאחר מכן לטעון את המדגם על הבמה ומרכז אותו מתחת לעדשה. כעת פתח את תוכנת ההדמיה ובחר צור משימה חדשה. עבור לעמודה של טופוגרפיה ובחר בלחצן המסייע. בחר את ההגדלה הנמוכה ביותר, אשר עבור מיקרוסקופ זה, הוא 2.5x. לאחר מכן השתמש במיקרוסקופ 3D מניפולטור כדי להתאים את מיקום Z של המדגם ולהביא את המדגם לפוקוס. לחץ על הכפתור בצד כך שאור כחול יופיע סביב הקצוות. זה מאפשר תנועה Z עדינה יותר ומיקוד. כעת ללכוד תמונת מבט כוללת.

הגדל לאט את הגדלת העדשה והתאם את עוצמת האור ואת המיקוד כדי להשיג את ההגדלה הרצויה. השתמשו במניפולטור תלת-ממד בכיווני X ו-Y כדי לבחור תחומי עניין שונים במדגם. לאחר צילום תמונה בהגדלה נמוכה, לחץ לצד נקודת התייחסות. השתמש בנקודת ההתייחסות המשמשת כברירת מחדל, או ציין נקודת התייחסות חדשה בפינת המדגם ולאחר מכן הקש הבא. כעת שנה בהדרגה את המטרה לרזולוציה הרצויה עבור המדגם. עבור מדגם זה, מטרה 20x משמש כדי לדמיין את התאים ברקמת המוח העכבר. ודא שיש מקום להקטין את מרחק העבודה.

כדי להגדיר את המרחק לאיסוף פרוסות, תחילה עבור לדף ההגדרה של טווח המדידה והשתמש במניפולציטור תלת-ממדי כדי להתאים סוף סוף את הדגימה בכיוון Z. לחץ על קבע אחרון כאשר החלק העליון של המדגם נמצא במוקד ולחץ על הגדר תחילה כאשר החלק התחתון של המדגם נמצא במוקד. ודא שמספר הפרוסות המחושב אינו עולה על 1,000 או שהתוכנית תיכשל. ודא שאין פיקסלים אדומים, מה שמצביע על כך שעוצמת האור רוויה יתר על המידה.

לבסוף, לחץ כדי לקחת את תמונת הטומוגרפיה. כאשר תוכנת הטומוגרפיה נפתחת, בחר בכרטיסיה מחקרים כדי להציג את הנתונים בתלת-ממד ולנקוט מדידות 2D ותל-ממד.

עכשיו מאפשר לקחת תמונה באמצעות מיקרוסקופ אופטי דיגיטלי. ראשית, הפעל את המיקרוסקופ ופתח את תוכנת ההדמיה. לאחר מכן לטעון את המדגם על הבמה ומרכז אותו מתחת לעדשה. כאשר תוכנת ההדמיה פתוחה, בחר משימה מרשימת התבניות או בחר בדיקה ללא תשלום. לאחר מכן, השג תמונת מבט כולל המציגה את כל הבמה. השתמש בבקר כדי לשנות את המוקד ואת מיקום התמונה.

לאחר השלמת הרכישה, מקם מערכת קואורדינטות על התמונה. מערכת הקואורדינטות המוגדרת כברירת מחדל נמצאת באמצע השלב. לקבלת גמישות רבה יותר, ניתן לשנות את הקואורדינטות באופן ידני.

לאחר מכן תן שם לדוגמה ובחר את לחצן המצלמה. לחץ על לחצן חי בעת ניווט המדגם והזז את המוקד כלפי מטה עד שהדגימה נמצאת בבירור במוקד. במידת הצורך, השתמש בכרטיסיית התאורה והצמצם כדי לכוונן את התאורה. לאחר מכן רכש תמונה של המדגם.

השתמש בכלים שמתחת ללוח מיטוב התמונה, כגון הטיית העדשה, רמות התאורה במדגם והבהירות וניגודיות בתמונה כדי למטב את התמונה לפריך הרצוי. כעת הקישו על כלי העיפרון כדי לבצע מדידות. השתמש בכלי המרחק והאזור כדי למדוד את גודל התאים במדגם.

לבסוף, עבור לכרטיסיה זרימת עבודה של תוצאות והגדר את פריסת הדוח. הקש על לחצן השמירה כדי לשמור את המשימה לניתוח נוסף.

עכשיו מאפשר לנתח את התמונות של מוח עכבר שנלקחו עם מיקרוסקופים אופטיים קונפוקליים ודיגיטליים. התמונה הקונפוקלית בהגדלה של פי 50 היא ברזולוציה גבוהה ומספקת מיקוד עמוק עם רמות עומק שונות של מידע.

במפה הטומוגרפית, גובה המדגם נע בין 1 לתשעה מיקרון. ניתן לנתח עוד יותר מאפיינים כגון משרעת, פרופיל חספוס ופרמטרים של עקומה. עם זאת, ניתן לדמיין את השקופית כולה של רקמת המוח המדורחת באמצעות מיקרוסקופ אופטי דיגיטלי.

הגדלה של מקטע מציגה פרטים נוספים של המדגם אך ברזולוציה נמוכה בהרבה מזו המתקבלת במיקרוסקופ קונפוקל. מדגם זה הושג בהגדלה של פי 300. תוכנה ייעודית מציעה כלים למדידת ממדים חתך, כגון הקוטר, כמו גם כדי לחשב את האזור הפנימי של המקטע.

מיקרוסקופיה דיגיטלית, אופטית וקונפוקלית הם כלים סטנדרטיים המשמשים ביישומים ביו-רפואיים שונים. סריקת רפטלמוסקופיית לייזר או SLO היא טכניקת הדמיה לא פולשנית המשמשת בהרחבה ברפואת עיניים קלינית כדי לאבחן ולנטר את התפתחותן של מחלות רשתית.

SLO מפיק תמונות סטריאוסקופיות עם ניגודיות גבוהה הממחישות את המיקרוגליה. המקרופאגים המקומיים של הרשתית, המעורבים במספר מחלות רשתית. מיקרוסקופיה קונפוקלית משמשת גם בהדמיית תאים חיים המאפשרת לחוקרים לדמיין את תפקוד התא הביולוגי המיקרוסקופי בזמן אמת.

טכניקה זו משמשת לחקר נדידת תאים והתפשטות ודינמיקה של חלבונים בין היתר. כאן, קולטני transmembrane וליזוזומים סומנו עם צבעים פלואורסצנטיים colocalization שלהם נותח באמצעות הדמיית timelapse כדי לחקור הפנמת קולטן.

הרגע צפיתם בהקדמה של JoVE למיקרוסקופיה דיגיטלית, אופטית וקונפוקל. כעת עליכם להבין את עקרונות המיקרוסקופיה ורזולוציית התמונה, כיצד להפעיל מיקרוסקופים אופטיים וקונפוקליים לדגימות ביולוגיות של תמונה, ומספר יישומים של השימוש בהם בתחום ההנדסה הביו-רפואית.

תודה שצפיתם.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Results

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

התמונות הבאות נותנות סקירה כללית של תוצאות שניתן להשיג של מוח עכבר באמצעות מיקרוסקופ קונפוקל. הם מראים כיצד ניתן להשיג רמות שונות של מידע וכיצד מפה טופוגרפית של התוצאות חושפת את גובה המדגם.

Figure 5
איור 5: תמונות קונפוקליות בהגדלה של פי 50 המציגות מוח עכבר בחתך. התמונה משמאל היא תמונה מורכבת שלוקחת את כל המישורים בפוקוס במהלך טומוגרפיה ויוצרת תמונה אחת ברזולוציה גבוהה וממוקדת עמוקות. התמונה מימין מציגה את המפה הטופוגרפית של המדגם.

Figure 6
איור 6: כדוגמה מייצגת טובה יותר ליישומי תלת-ממד של המיקרוסקופ הקונפוקל, התמונה ונותחה חור בפלסטיק. המפה הטופוגרפית המקורית נמצאת משמאל ושחזור תלת-ממד נמצא מימין.

Figure 7
איור 7: מציג את היקף ניתוח התוכנה של ConfoMap לצפייה בפרופיל משחזור תלת-ממדי. הפרמטרים משרעת, פרופיל חספוס, אפיון עקום מוצגים.

התמונות הבאות נותנות סקירה כללית של תוצאות שניתן להשיג משימוש במיקרוסקופ אופטי דיגיטלי על אותה פרוסת מוח עכבר. המיקרוסקופ הדיגיטלי מעניק שדה ראייה גדול יותר אך תמונות ברזולוציה נמוכה יותר מהמיקרוסקופ הקונפוקלי, שהוא אידיאלי להסתכל על רכיבים גדולים יותר או מבנים ביולוגיים. התוכנה כוללת כלי ניתוח שימושיים למדידת המדגם.

Figure 8
איור 8: תמונת סקירה המציגה פרוסת איבר שלמה.

Figure 9
איור 9: הגדלה בתמונה של מוח עכבר בחתך. הנה שדה ראייה של 300 מיקרון המתקבל עם תאורת קואקסיאלי וטבעת מעורבת, כמו גם ייצוב תמונה אלקטרוני.

Figure 10
איור 10: הדגמת יכולות המדידה של המיקרוסקופ האופטי הדיגיטלי. קוטר המדגם נמדד בצד שמאל, וחלוקה לרמות המוגדרת על-ידי המשתמש המשמשת לחישוב האזור הפנימי של מוח העכבר החלקי מוצגת בצד ימין. כלים אלה שימושיים בעת ניתוח דגימות ביולוגיות, שייתכן שאין להן קצוות זהים לצורות מוגדרות מראש.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Applications and Summary

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

בהדגמה זו, עומק המיקוד, שדה הראייה והרזולוציה המקסימלית וההגדלה של מיקרוסקופים אופטיים וקונפוקלים היו מותאמים לצפייה בדגימות ביולוגיות. הדגמה זו נועדה לעזור למשתתף להחליט איזה מודול מיקרוסקופיה הוא הטוב ביותר עבור יישום מסוים. לשני מצבי המיקרוסקופיה יש יתרונות בניתוח דגימות ביולוגיות על קלות ההכנה שלהם ותמונות מרוכבים ברזולוציה גבוהה.

היישומים למיקרוסקופיה אופטית וקונפוקל הם מרחיקי לכת. בשל ההכנה המדגם המוגבלת והיכולת לשלב מישורי תנועה ולהשתמש בטכניקות אור מעל לדגימה, כלים אלה מסוגלים להשיג מידע מרוב ערכות הנתונים. מיקרוסקופיה הייתה אפשרות פופולרית מאוד כאשר הדמיית תאים חיים, כגון אלה שטופלו בפלואורסצנטיות, אך היישומים יכולים לנוע בין משטחי הדמיה של מכשירים ביו-רפואיים לגילוי פגמים וחספוס לפני השתלתם בגוף. מיקרוסקופיה קונפוקלית ואופטית הם הסטנדרט הנוכחי עבור דגימות ביולוגיות הדמיה.

לבסוף, מיקרוסקופיה קונפוקלית מציעה הדמיה משופרת עם טכניקות פלואורסצנטיות. פלואורופורים במדגם יש חיים מוגבלים והוא יכול תמונה אקונומיקה כאשר נחשף כמויות גבוהות של אור. במיקרוסקופיה אור מסורתית, המדגם כולו מואר במהלך הדמיה, אשר גורמת להלבנה מהירה של תמונות. עם זאת, מאז רק חלק זעיר של המדגם מואר בבת אחת עם מיקרוסקופיה קונפוקלית, החיים של פלואורופור הוא ארוך יותר ויש פחות אתגרים הקשורים להלבנה תמונה.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Transcript

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the English version.

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter