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使用光学和共聚焦显微镜成像生物样本
 

使用光学和共聚焦显微镜成像生物样本

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显微镜是一种广泛用于成像样品详细结构的方法。光学显微镜通过一系列透镜聚焦光线以放大样品,在17世纪出现了第一台复合显微镜,已经使用了几个世纪。在此期间,Antonie van Leeuwenhoek 是第一个观察细菌、酵母、红血球和毛细血管循环的人,为微观发展做出了重大科学贡献。

光学显微镜至今仍广泛用于医学诊断的研究和临床设置。然而,在过去 60 年中,出现了共聚焦显微镜,通过针孔照亮样品,以提高光学分辨率和对比度。

本视频将说明光学和共聚焦显微镜的操作原理,展示如何分析高分辨率图像,并探讨显微镜在生物医学工程领域的几个应用。

让我们首先讨论共聚焦显微镜的基本原理。光学显微镜基于将光聚焦到样品上以成像其详细结构的原理。显微镜由两个放大元件组成;物镜,聚焦物体的真实图像,目镜,在眼睛接收之前聚焦放大的虚拟图像。总放大倍数是通过将这两个镜头的放大倍数乘以来实现的。

光的对焦为放大倍数和灯灯都在同一点相遇,从而给出指定的对焦平面,从而在图像中给出最佳分辨率。当在焦平面外部时,照明区域较大,光束会干扰样本的其他部分,导致图像模糊。当光学显微镜照亮并成像整个样品时,共聚焦显微镜利用样品级和探测器之间的针孔,以便一次只聚焦一个小光束。

因此,样本的唯一可见区域是焦点,提供解析良好的图像。但是,如果分辨率较高,则一次只能对此示例的一小部分进行成像。通过在 X-Y 平面中移动样品,可以对其表面进行栅格扫描。对于扫描的每个点,通过调整 Z 高度来访问不同的焦平面来优化焦点。这可确保图像样本的逐点分辨率最大化。

现在,让我们使用显微镜和图像分辨率的这些原则,使用共聚焦和光学显微镜对小鼠大脑进行成像。

在回顾了显微镜的主要原理后,现在让我们使用共聚焦显微镜进行测量。首先,打开计算机工作站的显微镜。然后将样品加载到舞台上,并将其居于镜头下方。现在打开映像软件并选择创建新作业。转到地形的列并选择辅助按钮。选择此显微镜的最低放大倍数为 2.5 倍。然后使用 3D 显微镜操纵器调整样品的 Z 位置,使样品聚焦。按下侧面的按钮,使边缘周围出现蓝光。这允许更精细的 Z 运动和对焦。现在捕获概览图像。

缓慢增加镜头放大倍率并调整光强和对焦以获得所需的放大倍率。使用 X 和 Y 方向中的 3D 操纵器在样品上选择不同感兴趣的区域。以低放大倍率拍摄图像后,按旁边取参考点。使用默认参考点,或在示例角指定新参考点,然后按下一步。现在逐渐将目标更改为样本所需的分辨率。对于这个样本,20x目标用于可视化小鼠脑组织中的细胞。确保有空间缩短工作距离。

要定义收集切片的距离,请先转到测量范围定义页,并使用 3D 操纵器最终调整 Z 方向的样本。当示例顶部处于焦点时,单击"上次设置";当示例底部处于焦点时,首先单击"设置"。确保计算切片数不超过 1,000 或程序将失败。验证没有红色像素,这表示光的强度过饱和。

最后,按完取断层扫描图像。打开断层扫描软件时,选择"算例"选项卡以 3D 格式查看数据,并进行 2D 和 3D 测量。

现在,让我们使用数字光学显微镜拍摄图像。首先,打开显微镜并打开成像软件。然后将样品加载到舞台上,并将其居于镜头下方。当成像软件打开时,从模板列表中选择作业或选择免费考试。然后,获取显示整个阶段的概述图像。使用控制器更改焦点和图像位置。

采集完成后,在图像上放置坐标系。默认坐标系位于舞台中间。为了更灵活,可以手动更改坐标。

然后命名示例并选择相机按钮。在导航示例时,按下实时按钮并向下移动焦点,直到示例清晰聚焦。如果需要,请使用照明和光圈选项卡来调整照明。然后获取示例的图像。

使用图像优化面板下的工具,例如镜头的倾斜度、样品上的照明级别以及图像中的亮度和对比度,以优化图像以达到所需的清晰度。现在,点击铅笔工具执行测量。使用距离和面积工具测量样本上的单元格大小。

最后,转到结果工作流选项卡并配置报表的布局。点击保存按钮以保存作业以供进一步分析。

现在,让我们分析使用共聚焦和数字光学显微镜拍摄的小鼠大脑的图像。50 倍放大的共聚焦图像具有高分辨率,可提供深度对焦,提供不同深度的信息。

在地形图上,该样本的高点范围为 1 到 9 微米。可以进一步分析振幅、粗糙度曲线和曲线参数等特征。然而,切片脑组织的整个幻灯片可以使用数字光学显微镜进行成像。

放大部分可显示样品的更多详细信息,但分辨率远低于共聚焦显微镜。该样本以300倍放大倍率获得。专用软件提供用于测量横截面尺寸(如直径)以及计算截面内部面积的工具。

数字、光学和共聚焦显微镜是各种生物医学应用的标准工具。扫描激光眼科或SLO是一种非侵入性成像技术,广泛用于临床眼科诊断和监测视网膜疾病的发展。

SLO 生成高对比度立体图像,使微胶质可视化。视网膜的常驻巨噬细胞,涉及多种视网膜疾病。共聚焦显微镜也用于活细胞成像,使研究人员能够实时可视化显微生物细胞功能。

该技术用于研究细胞迁移和增殖以及蛋白质动力学等。在这里,跨膜受体和地合体被标记与荧光染料,并分析其共定位使用延时成像研究受体内化。

您刚刚观看了 JoVE 对数字、光学和共聚焦显微镜的介绍。现在,您应该了解显微镜和图像分辨率的原理,如何操作光学和共聚焦显微镜来成像生物样品,以及它们在生物医学工程领域的几个应用。

谢谢你的收看。

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