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Imagerie d'échantillons biologiques avec microscopie optique et confocale
 

Imagerie d'échantillons biologiques avec microscopie optique et confocale

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La microscopie est une méthode largement utilisée pour imager la structure détaillée des échantillons. Les microscopes optiques, qui concentrent la lumière à travers une série de lentilles pour grossir les échantillons, sont utilisés depuis des siècles avec le premier microscope composé apparaissant au XVIIe siècle. Pendant ce temps, Antonie van Leeuwenhoek a été le premier à observer des bactéries, des levures, des globules rouges et la circulation dans les vaisseaux capillaires, apportant des contributions scientifiques importantes et ouvrant la voie à des progrès microscopiques.

Les microscopes optiques sont encore largement utilisés aujourd'hui dans la recherche et les milieux cliniques pour le diagnostic médical. Cependant, au cours des 60 dernières années, une microscopie confocale a vu le jour qui éclaire l'échantillon à travers un trou d'épingle pour augmenter la résolution optique et le contraste.

Cette vidéo illustrera les principes de fonctionnement de la microscopie optique et confocale, démontrera comment les images à haute résolution sont analysées et discutera de plusieurs applications de la microscopie dans le domaine du génie biomédical.

Commençons par discuter des principes fondamentaux de la microscopie confocale. La microscopie optique est basée sur le principe de concentrer la lumière sur un échantillon pour imager sa structure détaillée. Un microscope est formé de deux composants de grossissement; la lentille objective, qui concentre une image réelle d'un objet, et l'oculaire, qui concentre une image virtuelle agrandie avant qu'elle ne soit reçue par l'œil. Le grossissement total est atteint en multipliant les grossissements de ces deux lentilles.

La mise au point de la lumière donne un plan de mise au point spécifié où le grossissement et la lumière de la lampe se rencontrent tous au même point, ce qui donne la meilleure résolution dans l'image. Lorsqu'elle est à l'extérieur du plan focal, la zone d'éclairage est plus grande et les faisceaux lumineux interfèrent à partir d'autres parties de l'échantillon, ce qui provoque le flou de l'image. Lorsque les microscopes lumineux illuminent et imagent l'ensemble de l'échantillon en vue, un microscope confocal utilise un trou d'épingle entre l'étape de l'échantillon et le détecteur de sorte que seul un petit faisceau lumineux est focalisé à une profondeur étroite à la fois.

Par conséquent, la seule zone visible de l'échantillon, est le point d'orientation, fournissant une image bien résolue. Cependant, avec une résolution plus élevée, seule une petite partie de cet échantillon est imageà la fois. En déplaçant l'échantillon dans le plan X-Y, un balayage de raster de sa surface peut être exécuté. Pour chaque point de l'analyse, la mise au point est optimisée en ajustant la hauteur Z pour accéder à différents plans focaux. Cela garantit une résolution maximale point par point de l'échantillon d'image.

Maintenant, utilisons ces principes de microscopie et de résolution d'image pour imager un cerveau de souris à l'aide d'un microscope confocal et optique.

Après avoir examiné les principaux principes de la microscopie, nous allons maintenant effectuer une mesure à l'aide d'un microscope confocal. Tout d'abord, allumez le microscope à la station de travail informatique. Ensuite, chargez l'échantillon sur la scène et centrez-le sous la lentille. Maintenant, ouvrez le logiciel d'imagerie et sélectionnez créer un nouvel emploi. Passez à la colonne de topographie et choisissez le bouton assistant. Sélectionnez le grossissement le plus bas, qui pour ce microscope, est de 2,5x. Ensuite, utilisez le manipulateur de microscope 3D pour ajuster la position Z de l'échantillon et mettre l'échantillon au point. Appuyez sur le bouton sur le côté de sorte qu'une lumière bleue apparaît autour des bords. Cela permet un mouvement Z plus fin et la mise au point. Capturez maintenant une image d'aperçu.

Augmentez lentement le grossissement de la lentille et ajustez l'intensité lumineuse et la concentration pour obtenir le grossissement désiré. Utilisez le manipulateur 3D dans les directions X et Y pour sélectionner différents domaines d'intérêt sur l'échantillon. Une fois qu'une image est prise à faible grossissement, appuyez ensuite pour prendre un point de référence. Utilisez soit le point de référence par défaut, soit spécifiez un nouveau dans le coin de l'échantillon, puis appuyez ensuite. Maintenant, progressivement changer l'objectif à la résolution souhaitée pour l'échantillon. Pour cet échantillon, un objectif 20x est utilisé pour visualiser les cellules dans le tissu cérébral de la souris. Assurez-vous qu'il y a de la place pour réduire la distance de travail.

Pour définir la distance pour collecter des tranches, allez d'abord à la page de définition de la plage de mesure et utilisez le manipulateur 3D pour enfin ajuster l'échantillon dans la direction Z. Cliquez sur le dernier lorsque le haut de l'échantillon est au point et cliquez d'abord lorsque le bas de l'échantillon est au point. Assurez-vous que le nombre de tranches calculées ne dépasse pas 1 000 ou que le programme échouera. Vérifiez qu'il n'y a pas de pixels rouges, ce qui indique que l'intensité de la lumière est sursaturée.

Enfin, appuyez sur fait pour prendre l'image de tomographie. Lorsque le logiciel de tomographie s'ouvre, sélectionnez l'onglet études pour afficher les données en 3D et prendre des mesures 2D et 3D.

Maintenant permet de prendre une image à l'aide d'un microscope optique numérique. Tout d'abord, allumez le microscope et ouvrez le logiciel d'imagerie. Ensuite, chargez l'échantillon sur la scène et centrez-le sous la lentille. Lorsque le logiciel d'imagerie est ouvert, sélectionnez un emploi dans la liste des modèles ou choisissez un examen gratuit. Ensuite, acquérir une image de vue d'ensemble qui montre toute la scène. Utilisez le contrôleur pour modifier la mise au point et la position de l'image.

Une fois l'acquisition terminée, placez un système de coordonnées sur l'image. Le système de coordonnées par défaut se trouve au milieu de la scène. Pour plus de flexibilité, les coordonnées peuvent être modifiées manuellement.

Nommez ensuite l'échantillon et sélectionnez le bouton de l'appareil photo. Appuyez sur le bouton en direct lorsque vous naviguez dans l'échantillon et déplacez la mise au point vers le bas jusqu'à ce que l'échantillon soit clairement au point. Au besoin, utilisez l'onglet éclairage et ouverture pour ajuster l'éclairage. Ensuite, acquérir une image de l'échantillon.

Utilisez les outils sous le panneau d'optimisation de l'image, tels que l'inclinaison de la lentille, les niveaux d'éclairage sur l'échantillon, et la luminosité et le contraste dans l'image pour optimiser l'image à la netteté désirée. Maintenant, appuyez sur l'outil crayon pour effectuer des mesures. Utilisez la distance et les outils de zone pour mesurer la taille des cellules sur l'échantillon.

Enfin, allez à l'onglet flux de travail des résultats et configurez la mise en page du rapport. Appuyez sur le bouton enregistrer pour enregistrer l'emploi pour une analyse plus approfondie.

Maintenant permet d'analyser les images d'un cerveau de souris qui ont été prises avec des microscopes optiques confocaletetetet et numérique. L'image confocale à 50x grossissement est de haute résolution et fournit une mise au point profonde avec des niveaux de profondeur variables de l'information.

Sur la carte tomographique, le sommet de cet échantillon varie de un à neuf microns. Des caractéristiques telles que l'amplitude, le profil de rugosité et les paramètres de courbe peuvent être analysées plus en détail. Cependant, la diapositive entière du tissu cérébral sectionné peut être imaged utilisant un microscope optique numérique.

Zoom sur une section montre plus de détails de l'échantillon, mais à une résolution beaucoup plus faible que obtenue avec microscope confocal. Cet échantillon a été obtenu à 300x grossissement. Un logiciel dédié offre des outils pour mesurer les dimensions transversales, telles que le diamètre, ainsi que pour calculer la zone interne de la section.

La microscopie numérique, optique et confocale sont des outils standard utilisés dans diverses applications biomédicales. L'ophtalmose laser ou SLO est une technique d'imagerie non invasive qui est largement utilisée en ophtalmologie clinique pour diagnostiquer et surveiller le développement de maladies rétiniennes.

SLO produit des images stéréoscopiques à fort contraste qui visualisent la microglies. Les macrophages résidents de la rétine, qui sont impliqués dans plusieurs maladies rétiniennes. La microscopie confocale est également utilisée dans l'imagerie cellulaire vivante qui permet aux chercheurs de visualiser la fonction microscopique des cellules biologiques en temps réel.

Cette technique est utilisée pour étudier la migration cellulaire et la prolifération et la dynamique des protéines, entre autres. Ici, les récepteurs transmembrane s'ils ont été étiquetés avec des colorants fluorescents et leur colocalisation a été analysée à l'aide de l'imagerie par timelapse pour étudier l'internalisation des récepteurs.

Vous venez de regarder l'introduction de JoVE à la microscopie numérique, optique et confocale. Vous devez maintenant comprendre les principes de la microscopie et de la résolution d'images, comment utiliser les microscopes optiques et confocales pour imager des échantillons biologiques, et plusieurs applications de leur utilisation dans le domaine du génie biomédical.

Merci d'avoir regardé.

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