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Bildgebende biologische Proben mit optischer und konfokaler Mikroskopie
 

Bildgebende biologische Proben mit optischer und konfokaler Mikroskopie

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Mikroskopie ist eine Methode, die weit verbreitet ist, um die detaillierte Struktur der Proben abzubilden. Optische Mikroskope, die Licht durch eine Reihe von Linsen zur Vergrößerung von Proben fokussieren, sind seit Jahrhunderten im Einsatz, wobei das erste zusammengesetzte Mikroskop im 17. Jahrhundert auftauchte. Während dieser Zeit war Antonie van Leeuwenhoek die erste, die Bakterien, Hefe, rote Blutkörperchen und die Zirkulation in Kapillargefäßen beobachtete, bedeutende wissenschaftliche Beiträge leistete und den Weg für mikroskopische Fortschritte ebnete.

Optische Mikroskope sind auch heute noch weit verbreitet in der Forschung und klinischen Umgebungen für die medizinische Diagnose verwendet. In den letzten 60 Jahren ist jedoch eine konfokale Mikroskopie entstanden, die die Probe durch ein Loch beleuchtet, um die optische Auflösung und den Kontrast zu erhöhen.

Dieses Video wird die Funktionsprinzipien der optischen und konfokalen Mikroskopie veranschaulichen, zeigen, wie hochauflösende Bilder analysiert werden, und verschiedene Anwendungen der Mikroskopie im Bereich der biomedizinischen Technik diskutieren.

Lassen Sie uns zunächst über die Grundlagen der konfokalen Mikroskopie sprechen. Die optische Mikroskopie basiert auf dem Prinzip, Licht auf eine Probe zu fokussieren, um ihre detaillierte Struktur abzubilden. Ein Mikroskop besteht aus zwei Vergrößerungskomponenten; die objektive Linse, die ein reales Bild eines Objekts fokussiert, und das Okular, das ein vergrößertes virtuelles Bild fokussiert, bevor es vom Auge empfangen wird. Die Gesamtvergrößerung wird durch Multiplikation der Vergrößerungen dieser beiden Linsen erreicht.

Die Fokussierung des Lichts gibt eine bestimmte Fokusebene, wo die Vergrößerung und das Lampenlicht alle an der gleichen Stelle treffen, was die beste Auflösung im Bild ergibt. Wenn außerhalb der Brennebene, ist der Bereich der Beleuchtung größer und Lichtstrahlen stören von anderen Teilen der Probe, wodurch das Bild verschwommen wird. Wenn Lichtmikroskope die gesamte Probe im Blick aufleuchten und abbilden, nutzt ein konfokales Mikroskop ein Pinloch zwischen der Probenstufe und dem Detektor, so dass jeweils nur ein kleiner Lichtstrahl in einer engen Tiefe fokussiert wird.

Folglich ist der einzige sichtbare Bereich der Stichprobe der Fokuspunkt, der ein gut aufgelöstes Bild liefert. Bei höherer Auflösung wird jedoch nur ein kleiner Teil dieses Beispiels gleichzeitig abgebildet. Durch Verschieben des Samples in der X-Y-Ebene kann ein Raster-Scan seiner Oberfläche durchgeführt werden. Für jeden Punkt des Scans wird der Fokus optimiert, indem die Z-Höhe angepasst wird, um auf verschiedene Fokusebenen zuzugreifen. Dadurch wird eine maximale Auflösung Punkt für Punkt des Bildbeispiels sichergestellt.

Lassen Sie uns nun diese Prinzipien der Mikroskopie und Bildauflösung verwenden, um ein Maushirn sowohl mit einem konfokalen als auch einem optischen Mikroskop abzubilden.

Nachdem wir die wichtigsten Prinzipien der Mikroskopie überprüft haben, führen wir nun eine Messung mit einem konfokalen Mikroskop durch. Schalten Sie zunächst das Mikroskop am Computerarbeitsplatz ein. Dann laden Sie das Sample auf die Bühne und zentrieren Sie es unter der Linse. Öffnen Sie nun die Bildverarbeitungssoftware und wählen Sie neue Aufgabe erstellen aus. Wechseln Sie zur Spalte Topographie, und wählen Sie die Schaltfläche "Assistent". Wählen Sie die niedrigste Vergrößerung, die für dieses Mikroskop 2,5x beträgt. Verwenden Sie dann den 3D-Mikroskopmanipulator, um die Z-Position der Probe einzustellen und die Probe in den Fokus zu rücken. Drücken Sie die Taste an der Seite, sodass ein blaues Licht um die Ränder erscheint. Dies ermöglicht eine feinere Z-Bewegung und Fokussierung. Erfassen Sie nun ein Übersichtsbild.

Erhöhen Sie langsam die Linsenvergrößerung und passen Sie die Lichtintensität und den Fokus an, um die gewünschte Vergrößerung zu erhalten. Verwenden Sie den 3D-Manipulator in X- und Y-Richtung, um verschiedene Interessenbereiche für die Probe auszuwählen. Sobald ein Bild bei geringer Vergrößerung aufgenommen wurde, drücken Sie neben, um einen Referenzpunkt zu nehmen. Verwenden Sie entweder den Standardreferenzpunkt, oder geben Sie einen neuen in der Ecke des Beispiels an, und drücken Sie dann als Nächstes. Ändern Sie nun schrittweise das Ziel in die gewünschte Auflösung für die Stichprobe. Für diese Probe wird ein 20-faches Objektiv verwendet, um die Zellen im Gehirngewebe der Maus zu visualisieren. Stellen Sie sicher, dass Platz vorhanden ist, um den Arbeitsabstand zu verringern.

Um den Abstand zum Sammeln von Slices zu definieren, gehen Sie zuerst zur Messbereichsdefinitionsseite und verwenden Sie den 3D-Manipulator, um die Probe schließlich in Z-Richtung anzupassen. Klicken Sie auf Letzte einstellung, wenn der obere Teil des Beispiels im Fokus ist, und klicken Sie zuerst auf "Satz", wenn der Unterr des Beispiels im Fokus ist. Stellen Sie sicher, dass die Anzahl der berechneten Slices 1.000 nicht überschreitet oder das Programm fehlschlägt. Stellen Sie sicher, dass keine roten Pixel vorhanden sind, was darauf hinweist, dass die Lichtintensität übersättigt ist.

Drücken Sie schließlich auf " Tun", um das Tomographiebild zu nehmen. Wenn die Tomographie-Software geöffnet wird, wählen Sie die Registerkarte Studien aus, um die Daten in 3D anzuzeigen und 2D- und 3D-Messungen durchzuführen.

Jetzt können Wir ein Bild mit einem digitalen optischen Mikroskop aufnehmen. Schalten Sie zunächst das Mikroskop ein und öffnen Sie die Bildgebungssoftware. Dann laden Sie das Sample auf die Bühne und zentrieren Sie es unter der Linse. Wenn die Bildverarbeitungssoftware geöffnet ist, wählen Sie einen Auftrag aus der Liste der Vorlagen aus, oder wählen Sie eine kostenlose Untersuchung aus. Erwerben Sie dann ein Übersichtsbild, das die gesamte Bühne zeigt. Verwenden Sie den Controller, um den Fokus und die Bildposition zu ändern.

Sobald die Erfassung abgeschlossen ist, platzieren Sie ein Koordinatensystem auf dem Bild. Das Standardkoordinatensystem befindet sich in der Mitte der Stufe. Für mehr Flexibilität können die Koordinaten manuell geändert werden.

Benennen Sie dann das Beispiel, und wählen Sie die Kamerataste aus. Drücken Sie die Live-Taste, während Sie durch die Probe navigieren, und bewegen Sie den Fokus nach unten, bis die Probe deutlich im Fokus ist. Verwenden Sie bei Bedarf die Beleuchtungs- und Blendenlasche, um die Beleuchtung anzupassen. Dann erfassen Sie ein Bild der Probe.

Verwenden Sie die Werkzeuge unter dem Bildoptimierungsfenster, z. B. die Neigung des Objektivs, die Beleuchtungsstärken auf der Probe und die Helligkeit und den Kontrast im Bild, um das Bild auf die gewünschte Schärfe zu optimieren. Tippen Sie nun auf das Bleistiftwerkzeug, um Messungen durchzuführen. Verwenden Sie die Entfernungs- und Flächenwerkzeuge, um die Größe der Zellen in der Probe zu messen.

Wechseln Sie schließlich zur Registerkarte Ergebnisworkflow, und konfigurieren Sie das Layout des Berichts. Tippen Sie auf die Schaltfläche Speichern, um den Auftrag für die weitere Analyse zu speichern.

Jetzt können wir die Bilder eines Maushirns analysieren, die mit konfokalen und digitalen optischen Mikroskopen aufgenommen wurden. Das konfokale Bild bei 50-facher Vergrößerung ist hochauflösend und bietet einen tiefen Fokus mit unterschiedlichen Tiefengraden.

Auf der tomografischen Karte reicht die Höhe dieser Stichprobe von ein bis neun Mikrometern. Merkmale wie Amplitude, Rauheitsprofil und Kurvenparameter können weiter analysiert werden. Das gesamte Dia des geschnittenen Hirngewebes kann jedoch mit einem digitalen optischen Mikroskop abgebildet werden.

Das Vergrößern eines Abschnitts zeigt mehr Details der Probe, aber mit einer viel niedrigeren Auflösung als mit konfokalen Mikroskoperhaltenen. Diese Probe wurde bei 300-facher Vergrößerung gewonnen. Spezielle Software bietet Werkzeuge, um Querschnittsabmessungen zu messen, wie z. B. den Durchmesser, sowie den inneren Bereich des Abschnitts zu berechnen.

Digitale, optische und konfokale Mikroskopie sind Standardwerkzeuge, die in verschiedenen biomedizinischen Anwendungen eingesetzt werden. Scanning Laser Ophthalmoscopy oder SLO ist eine nicht-invasive bildgebende Technik, die ausgiebig in der klinischen Ophthalmologie verwendet wird, um die Entwicklung von Netzhauterkrankungen zu diagnostizieren und zu überwachen.

SLO produziert stereoskopische Bilder mit hohem Kontrast, die die Mikroglia visualisieren. Die ansässigen Makrophagen der Netzhaut, die an mehreren Netzhauterkrankungen beteiligt sind. Konfokale Mikroskopie wird auch in der Live-Zell-Bildgebung verwendet, die es Forschern ermöglicht, mikroskopische biologische Zellfunktion in Echtzeit zu visualisieren.

Diese Technik wird unter anderem verwendet, um Zellmigration und Proliferation und Proteindynamik zu untersuchen. Hier wurden Transmembranrezeptoren und Lysosomen mit fluoreszierenden Farbstoffen beschriftet und ihre Kolokalisierung mittels Zeitraffer-Bildgebung zur Untersuchung der Rezeptorinternalisierung analysiert.

Sie haben gerade JoVeTs Einführung in die digitale, optische und konfokale Mikroskopie gesehen. Sie sollten nun die Prinzipien der Mikroskopie und Bildauflösung verstehen, wie sowohl optische als auch konfokale Mikroskope an bildbiologischen Proben betrieben werden können, und verschiedene Anwendungen ihrer Verwendung im Bereich der biomedizinischen Technik.

Danke fürs Zuschauen.

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