Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Science Education Library
Biomedical Engineering

A subscription to JoVE is required to view this content.
You will only be able to see the first 20 seconds.

Imágenes de muestras biológicas con microscopía óptica y confocal
 

Imágenes de muestras biológicas con microscopía óptica y confocal

Article

Transcript

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the English version.

La microscopía es un método que se utiliza ampliamente para tomar imágenes de la estructura detallada de las muestras. Los microscopios ópticos, que enfocan la luz a través de una serie de lentes para magnificar muestras, han estado en uso durante siglos con el primer microscopio compuesto que aparece en el siglo XVII. Durante ese tiempo, Antonie van Leeuwenhoek fue el primero en observar bacterias, levaduras, glóbulos rojos y circulación en vasos capilares, haciendo contribuciones científicas significativas y allanando el camino para los avances microscópicos.

Los microscopios ópticos todavía se utilizan ampliamente hoy en día en la investigación y entornos clínicos para el diagnóstico médico. Sin embargo, en los últimos 60 años ha surgido una microscopía confocal que ilumina la muestra a través de un agujero para aumentar la resolución óptica y el contraste.

Este video ilustrará los principios operativos de la microscopía óptica y confocal, demostrará cómo se analizan las imágenes de alta resolución y discutirá varias aplicaciones de la microscopía en el campo de la ingeniería biomédica.

Comencemos discutiendo los fundamentos de la microscopía confocal. La microscopía óptica se basa en el principio de enfocar la luz en una muestra para crear una imagen de su estructura detallada. Un microscopio se forma de dos componentes de aumento; la lente objetivo, que enfoca una imagen real de un objeto, y el ocular, que enfoca una imagen virtual magnificada antes de que sea recibida por el ojo. El aumento total se logra multiplicando las ampliaciones de estas dos lentes.

El enfoque de la luz proporciona un plano de enfoque especificado donde la ampliación y la luz de la lámpara se encuentran en el mismo punto, lo que proporciona la mejor resolución en la imagen. Cuando está fuera del plano focal, el área de iluminación es más grande y los haces de luz interfieren desde otras partes de la muestra, lo que hace que la imagen sea borrosa. Cuando los microscopios de luz iluminan e ilustran toda la muestra a la vista, un microscopio confocal utiliza un orificio de pasador entre la etapa de la muestra y el detector para que solo un haz de luz pequeño se enfoque a una profundidad estrecha a la vez.

Por lo tanto, el único área visible de la muestra, es el punto de enfoque, proporcionando una imagen bien resuelta. Sin embargo, con una resolución más alta, solo se muestra una pequeña parte de esta muestra a la vez. Al mover la muestra en el plano X-Y, se puede realizar un escaneo ráster de su superficie. Para cada punto del escaneo, el enfoque se optimiza ajustando la altura Z para acceder a diferentes planos focales. Esto garantiza una resolución máxima punto por punto de la muestra de imagen.

Ahora vamos a usar estos principios de microscopía y resolución de imagen para tomar imágenes de un cerebro de ratón usando un microscopio confocal y óptico.

Después de haber revisado los principios principales de la microscopía, ahora vamos a realizar una medición utilizando un microscopio confocal. Primero, encienda el microscopio en la estación de trabajo de la computadora. A continuación, cargue la muestra en el escenario y céndala debajo de la lente. Ahora abra el software de imágenes y seleccione crear un nuevo trabajo. Vaya a la columna de topografía y elija el botón asistente. Seleccione el aumento más bajo, que para este microscopio, es 2.5x. A continuación, utilice el manipulador del microscopio 3D para ajustar la posición Z de la muestra y enfocar la muestra. Presione el botón en el lado para que aparezca una luz azul alrededor de los bordes. Esto permite un movimiento Z más fino y enfoque. Ahora captura una imagen general.

Aumente lentamente el aumento de la lente y ajuste la intensidad de la luz y el enfoque para obtener el aumento deseado. Utilice el manipulador 3D en las direcciones X e Y para seleccionar diferentes áreas de interés en la muestra. Una vez que una imagen se toma con bajo aumento, pulse siguiente para tomar un punto de referencia. Utilice el punto de referencia predeterminado o especifique uno nuevo en la esquina del ejemplo y, a continuación, presione siguiente. Ahora cambie gradualmente el objetivo a la resolución deseada para la muestra. Para esta muestra, se utiliza un objetivo de 20x para visualizar las células en el tejido cerebral del ratón. Asegúrese de que hay espacio para reducir la distancia de trabajo.

Para definir la distancia para recopilar sectores, primero vaya a la página de definición del rango de medición y utilice el manipulador 3D para finalmente ajustar la muestra en la dirección Z. Haga clic en establecer último cuando la parte superior de la muestra esté enfocada y haga clic en establecer primero cuando la parte inferior de la muestra esté enfocada. Asegúrese de que el número de sectores calculados no supere los 1.000 o que el programa falle. Compruebe que no haya píxeles rojos, lo que indica que la intensidad de la luz está sobresaturada.

Por último, pulse para tomar la imagen de la tomografía. Cuando se abra el software de tomografía, seleccione la pestaña de estudios para ver los datos en 3D y tomar medidas 2D y 3D.

Ahora vamos a tomar una imagen usando un microscopio óptico digital. En primer lugar, encienda el microscopio y abra el software de imágenes. A continuación, cargue la muestra en el escenario y céndala debajo de la lente. Cuando el software de imágenes esté abierto, seleccione un trabajo de la lista de plantillas o elija el examen gratuito. A continuación, adquiera una imagen de resumen que muestre toda la etapa. Utilice el controlador para cambiar el enfoque y la posición de la imagen.

Una vez completada la adquisición, coloque un sistema de coordenadas en la imagen. El sistema de coordenadas predeterminado está en el centro de la etapa. Para una mayor flexibilidad, las coordenadas se pueden cambiar manualmente.

A continuación, asigne un nombre a la muestra y seleccione el botón de la cámara. Pulse el botón live mientras navega por la muestra y mueva el foco hacia abajo hasta que la muestra esté claramente enfocada. Si es necesario, utilice la pestaña de iluminación y apertura para ajustar la iluminación. A continuación, adquiera una imagen de la muestra.

Utilice las herramientas del panel de optimización de imagen, como la inclinación de la lente, los niveles de iluminación de la muestra y el brillo y el contraste de la imagen para optimizar la imagen a la nitidez deseada. Ahora toque la herramienta de lápiz para realizar mediciones. Utilice las herramientas de distancia y área para medir el tamaño de las celdas de la muestra.

Por último, vaya a la pestaña de flujo de trabajo de resultados y configure el diseño del informe. Toque el botón Guardar para guardar el trabajo para su análisis posterior.

Ahora vamos a analizar las imágenes de un cerebro de ratón que fueron tomadas con microscopios ópticos confocales y digitales. La imagen confocal con un aumento de 50x es de alta resolución y proporciona un enfoque profundo con diferentes niveles de profundidad de información.

En el mapa tomográfico, el máximo de esta muestra oscila entre uno y nueve micras. Se pueden analizar más a fondo características como la amplitud, el perfil de rugosidad y los parámetros de curva. Sin embargo, toda la diapositiva del tejido cerebral seccionado se puede fotomente usando un microscopio óptico digital.

Acercar una sección muestra más detalles de la muestra pero con una resolución mucho menor que la obtenida con el microscopio confocal. Esta muestra se obtuvo con un aumento de 300x. El software dedicado ofrece herramientas para medir las dimensiones transversales, como el diámetro, así como para calcular el área interna de la sección.

La microscopía digital, óptica y confocal son herramientas estándar utilizadas en diversas aplicaciones biomédicas. La exploración de oftalmoscopia láser o SLO es una técnica de imagen no invasiva que se utiliza ampliamente en oftalmología clínica para diagnosticar y monitorear el desarrollo de enfermedades de la retina.

SLO produce imágenes estereoscópicas de alto contraste que visualizan la microglia. Los macrófagos residentes de la retina, que están involucrados en varias enfermedades de la retina. La microscopía confocal también se utiliza en imágenes de células vivas que permite a los investigadores visualizar la función celular biológica microscópica en tiempo real.

Esta técnica se utiliza para estudiar la migración celular y la proliferación y la dinámica de proteínas entre otros. Aquí, los receptores transmembrana y los sosomas fueron etiquetados con colorantes fluorescentes y su colocalización fue analizada usando imágenes de timelapse para investigar la internalización de los receptores.

Acabas de ver la introducción de JoVE a la microscopía digital, óptica y confocal. Ahora debe comprender los principios de la microscopía y la resolución de imagen, cómo operar microscopios ópticos y confocales para tomar imágenes de muestras biológicas, y varias aplicaciones de su uso en el campo de la ingeniería biomédica.

Gracias por mirar.

Read Article

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
simple hit counter