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Magnetaktivierte Zellsortierung (MACS)
 

Magnetaktivierte Zellsortierung (MACS): Isolierung von Thymic T Lymphozyten

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Die magnetisch aktivierte Zellsortierung (MACS) ist eine Technik, die es Forschern ermöglicht, Zellen auf der Grundlage spezifischer Epitope, die auf ihren Oberflächen exprimiert werden, zu trennen.

Der Prozess beginnt in der Regel mit der Extraktion eines Organs oder Gewebes, wie dem Thymus. Dann werden die Zellen mechanisch getrennt, in der Regel durch Zerkleinern, bis das Gewebe in einzelne Zellen zerlegt wird. Unerwünschte Zellen können in diesem Stadium durch Zugabe von Chemikalien entfernt werden. Zum Beispiel kann Ammoniumchlorid-Kalium oder ACK-Puffer verwendet werden, um unerwünschte Erythrozyten zu lysieren.

Als nächstes wird der Suspension ein Antikörper hinzugefügt, der mit einem Molekül namens Biotin konjugiert wird, und diese Komplexe binden an die Epitope der Oberfläche der Zielzellen. Biotin hat eine hohe Affinität zu einem anderen Molekül namens Streptavidin. Im nächsten Schritt werden den Antikörper-markierten Zellen Streptavidin-Moleküle zu magnetischen Perlen hinzugefügt. Wenn Biotin und Streptavidin in Kontakt kommen, binden sie fest. Das Ergebnis ist, dass die Interessenszellen mit magnetischen Perlen beschichtet sind. Dieser Komplex wird manchmal als Sandwich bezeichnet. In diesem Fall, CD3 auf der Zellmembran auf der Unterseite, dann Anti-CD3 konjugiert zu Biotin, und schließlich, Streptavidin konjugiert zu magnetischen Perlen.

Diese beschrifteten Zellen können nun in eine Spalte mit einer Matrix platziert werden, die, unterstützt durch die Schwerkraft, die Zellen langsam durch einen Magneten passieren lässt. Dabei kleben die magnetischen, mit Perlen beschrifteten Zellen am Rand des Rohres, das dem Magnet am nächsten liegt, während die nicht beschrifteten Zellen in einem Sammelrohr weitergeführt werden. Als nächstes können die beschrifteten Zellen aus der Säule entfernt werden, indem sie einfach den Magneten entfernen, eine Eluentenlösung hinzufügen und sanften Druck mit einem Kolben anwenden, um sie aus der Säule in ein frisches Sammelrohr zu spülen. Letztlich ermöglicht dieser Prozess 60 bis 98% Abruf der Zellen von Interesse.

In diesem Verfahren werden wir thymische Leukozyten von einer Maus isolieren und MACS verwenden, um CD3-positive T-Zellen zu sortieren, bevor wir die Effizienz der Sortierung mit FACS bestätigen.

Zunächst sollten Sie alle geeigneten Schutzausrüstungen einschließlich Labormantel und Handschuhe anziehen. Als nächstes waschen Sie eine Schere und Zange mit 70% Ethanol und trocknen Sie sie mit einem sauberen Papiertuch. Dann bereiten 200 Milliliter HBSS 2% fetale Kalbsserum, oder FCS, durch Mischen von vier Milliliter FCS mit 196 Milliliter HBSS.

Pin eine eingeschläferte Maus in einer Supine-Position auf einer Sezierplatte. Führen Sie mit Schere und Zange eine Längs-Laparotomie durch, um auf die Brusthöhle zuzugreifen. Entfernen Sie zuerst das Herz, um Zugang zum Thymus zu erhalten, der sich über dem Herzen befindet. Identifizieren Sie dann den Thymus, der aus zwei weißen Lappen besteht. Mit Zangen, lösen Sie den Thymus vorsichtig und legen Sie ihn auf eine Petrischale mit fünf MilliliterHBS2% FCS.

Um die Immunzellen zu isolieren, legen Sie den Thymus zunächst auf ein 40 Mikrometer Zellsieb in der Petrischale. Zerkleinern Sie das Gewebe mit einem Kolben, um es in die Schale zu dissoziieren. Danach spülen Sie den Kolben und das Sieb mit HBSS 2% FCS, um alle haftenden Zellen wiederherzustellen. Dann pipette die dissoziierten Thymuszellen und Flüssigkeit aus der Petrischale in ein 15 Milliliter Zentrifugenrohr. Waschen Sie die Petrischale mit fünf Millilitern HBSS 2% FCS und übertragen Sie diese Waschlösung auch auf das 15 Milliliter Zentrifugenrohr.

Als nächstes zentrifugieren Sie das Rohr bei 370 mal g für sieben Minuten bei 20 Grad Celsius. Entsorgen Sie den Überstand und setzen Sie das Pellet in zwei MilliliterACK-Lysingpuffer wieder auf, um die Erythrozyten zu lyse. Zwei Minuten bei Raumtemperatur auf der Bankplatte inkubieren. Dann bringen Sie das Volumen auf 14 Milliliter mit HBSS 2% FCS. Zentrifugieren Sie das Rohr bei 370 mal g für sieben Minuten bei 20 Grad Celsius. Entsorgen Sie dann den Überstand und setzen Sie die Zellen in fünf Millilitern HBSS 2% FCS wieder aus.

Schätzen Sie die Zellkonzentration anhand eines Malassez-Dias, wie im Protokoll zur FACS-Isolierung von B-Lymphozyten gezeigt, und passen Sie die Zellkonzentration auf 10 auf die siebten Zellen pro Milliliter mit HBSS 2% FCS an.

Übertragen Sie 500 Mikroliter Zelllösung in zwei FACS-Röhren. Beschriften Sie eine Röhre nicht angereicherte T-Zellen und die anderen röhrenangereicherten T-Zellen, die durch magnetische Beschriftung getrennt werden.

Zentrifugieren Sie das angereicherte T-Zellen-Rohr bei 370 mal g für drei Minuten bei 20 Grad Celsius. Entsorgen Sie den Überstand und setzen Sie das Pellet in 250 Mikroliter Biotin gekoppelten Anti-CD3-Antikörper verdünnt ein s.in 400 in HBSS 2% FCS. Inkubieren Sie die Zellen für 20 Minuten auf Eis und im Dunkeln. Fügen Sie drei Milliliter HBSS 2% FCS in die Rohre und zentrifugieren Sie sie wieder bei 370 mal g für drei Minuten bei 20 Grad Celsius. Entsorgen Sie den Überstand und setzen Sie das Pellet in 250 MikroliterStreptavidin-gekoppelten Perlen in HBSS 2% FCS verdünnt. Die Mischung aus Zellen und Perlen 20 Minuten lang auf Eis bebrüten. Als nächstes fügen Sie drei Milliliter HBSS 2% FCS in das Rohr, Pipette nach oben und unten zu mischen, und Zentrifuge wieder bei 370 mal g für drei Minuten bei 20 Grad Celsius. Setzen Sie das Pellet in zwei Milliliter HBSS 2% FCS aus.

Legen Sie die Säule auf den Magneten und fügen Sie drei Milliliter HBSS 2% FCS hinzu, um das System zu befeuchten. Dann pipette die gefärbten Zellen in die Spalte. Nachdem die Zellsuspension durch die Säule geht, waschen Sie die Säule dreimal mit drei Millilitern HBSS 2% FCS. Entfernen Sie als Nächstes die Säule vom Magneten und legen Sie sie in ein 15-Milliliter-Rohr. Um die Zielzellen zu löschen, fügen Sie der Spalte fünf Milliliter HBSS 2% FCS hinzu und spülen Sie die Spalte mit einem Kolben. Wiederholen Sie diesen Schritt mit weiteren fünf Millilitern HBSS 2% FCS.

Um die Wirksamkeit der Zielzellisolierung zu bewerten, übertragen Sie zunächst 500 Mikroliter eluierte Zellsuspension in ein FACS-Rohr und beschriften Sie sie angereicherte T-Zellen. Dann zentrifugieren Sie sowohl die angereicherten als auch die nicht angereicherten Rohre bei 370 mal g für sieben Minuten bei 20 Grad Celsius. Entsorgen Sie den Überstand, und fügen Sie dann 100 Mikroliter fluoreszierender Antikörper, der in 200 in HBSS 2% FCS verdünnt wird, in beide Röhren. Inkubieren Sie die Zellen für 20 Minuten auf Eis und im Dunkeln. Als nächstes fügen Sie drei Milliliter HBSS 2% FCS in die Rohre und zentrifugieren Sie sie bei 370 mal g für drei Minuten bei 20 Grad Celsius. Entsorgen Sie den Überstand, und setzen Sie die Pellets in 250 Mikroliter HBSS 2% FCS wieder aus. Bewerten Sie nun die CD3-positive Zellanreicherungsrate mithilfe der Durchflusszytometrie, wie im FACS-Protokoll gezeigt.

Nun werden wir die Häufigkeit von CD3-positiven Lymphozyten unter allen Thymosyten bestimmen, die vom Mausthymus isoliert wurden. Um zu starten, doppelklicken Sie auf das FlowJo-Symbol und ziehen Sie die Dateien für jede Röhre im gesamten Beispielfenster. Doppelklicken Sie dann auf die angereicherte T-Zellen-Datei, um die zellen, die von dieser Probe aufgezeichnet wurden, auf einem Punktdiagramm anzuzeigen, das Vorwärtsstreuung, FSCA auf der x-Achse und Seitenstreuung, SSCA, auf der y-Achse anzeigt.

Klicken Sie auf Polygon, um die Lymphozytenpopulationen zu umkreisen. Doppelklicken Sie anschließend auf die eingekreiste Grundgesamtheit, um ein neues Fenster zu erstellen. Wählen Sie FSC-W auf der y-Achse und FSC-A auf der x-Achse und kreisen Sie die FSA-W-Negativzellen. Benennen Sie im Identifikationsfenster für die Untergrundgesamtheit die Zellenpopulation Als Einzelzellen. Klicken Sie als Nächstes im Identifikationsfenster der Untergrundbevölkerung auf OK und doppelklicken Sie dann auf die eingekreiste Grundgesamtheit, um ein neues Fenster zu erstellen. Wählen Sie CD3 auf der y-Achse aus, und kreisen Sie die CD3-positiven Zellen. Benennen Sie im Identifikationsfenster für die Untergrundgesamtheit Die T-Zellen Der Zellenderpopulation. Wiederholen Sie dies mit der nicht angereicherten T-Zellen-Datei. Um die Zellenpopulation zu visualisieren, klicken Sie auf Layout-Editor, und ziehen Sie die T-Zellen-Population aus angereicherten T-Zellen und nicht angereicherten T-Zellen-Dateien auf die Registerkarte.

Punktdiagramme, die CD3-positive Lymphozyten darstellen, werden angezeigt. CD3-positive Zellen sollten nur in der Population von Interesse in der CD3-positiven angereicherten Röhre erscheinen. Um die Anreicherung von CD3-positiven Lymphozyten in den sortierten Zellen auszuwerten, klicken Sie auf den Tabelleneditor, und ziehen Sie dann die T-Zellen-Population aus angereicherten T-Zellen und nicht angereicherten T-Zellen-Dateien in die Tabelle. Wählen Sie im Statistikmenü Frequenz der Lymphozytenzellen aus, um den Prozentsatz der CD3-positiven Zellen in allen Lymphozyten zu überprüfen. Klicken Sie dann auf Tabelle erstellen. Parameterwerte werden in einer neuen Tabelle angezeigt. Bei den angereicherten T-Zellen sollte die Frequenz von CD3-positiven Zellen bei etwa 80% oder höher liegen.

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