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Cultures d'enrichissement : Cultiver des microbes aérobies et anaérobies sur les médias sélectifs et différentiels

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Les bactéries sont capables d'habiter presque tous les environnements de la Terre, de la toundra du désert aux forêts tropicales humides. Cette capacité à coloniser des niches très différentes est due à leur adaptabilité et à leur grande diversité métabolique, ce qui leur permet d'utiliser une grande variété de molécules pour la production d'énergie. C'est ce vaste éventail de diversité qui conduit au phénomène que moins de 1% des espèces bactériennes sur la planète sont considérées comme culturables et celles-ci ne sont possibles que par une compréhension de leurs besoins métaboliques et environnementaux spécifiques.

L'exécution de manipulations des médias et de l'environnement en laboratoire permet non seulement aux chercheurs d'expérimenter pour trouver les conditions optimales pour la culture d'une espèce d'intérêt, mais elle permet également l'enrichissement, le processus de changement des conditions à choisir pour espèces spécifiques d'une culture mixte. Certaines espèces microbiennes sont généralistes et capables de tolérer une grande variété d'états ou d'environnements. Ces organismes peuvent se développer facilement dans des conditions de laboratoire, mais ils peuvent également être empêchés de croître s'ils reçoivent un habitat extrême - ce qui peut aider si l'objectif est d'enrichir pour les organismes d'une culture mixte qui sont tolérants à cette condition.

Les organismes exigeants peuvent être culturables, mais seulement lorsque des conditions spécifiques sont remplies. Les espèces de Neisseria ou haemophilus, par exemple, nécessitent des supports contenant des globules rouges partiellement décomposés et une forte concentration de dioxyde de carbone, ce qui peut également décourager la croissance d'autres espèces. Les extrémophiles sont nommés en fonction de leur préférence pour les conditions extrêmes, telles que des températures très basses ou élevées, des conditions réduites ou d'absence d'oxygène, ou en présence de haute teneur en sel. Ces conditions sont probablement intolérables à la plupart des autres microbes.

Pour enrichir davantage pour un organisme d'intérêt, certains types de médias contiennent des indicateurs qui donnent un aperçu du métabolisme de l'organisme. Mannitol Salt Agar inhibe la croissance d'organismes sensibles au sel élevé. Gram bactéries négatives ne peuvent généralement pas survivre, mais le genre Gram positif Staphylococcus sont en mesure de prospérer. En outre, l'agar MSA indique toutes les colonies capables de fermenter le mannitol parce que les sous-produits acides de la fermentation transformeront l'indicateur rouge méthyle dans les médias à un jaune vif. Cela peut permettre une sélection plus spécifique d'une espèce.

Un autre moyen d'enrichissement courant, Eosin Methylène Blue, contient de l'éosine et des colorants bleus méthylène, qui sont toxiques pour les organismes positifs au gramme. Il contient également du lactose et des bactéries sur ces plaques qui peuvent fermenter ce qui produira des acides qui abaissent le pH encourageant l'absorption des colorants. Ces colonies prennent de grandes quantités de pigments et semblent sombres et métalliques. Dans ce laboratoire, vous cultiverez quatre organismes d'essai différents à travers trois conditions différentes de médias, puis dans des conditions aérobies par rapport à des conditions anaérobies avant d'observer leur développement.

Avant de commencer l'expérience, lavez-vous soigneusement les mains et séchez-les, avant de mettre des gants de laboratoire de taille appropriée. Ensuite, stérilisez la surface de travail avec 5% d'eau de Javel, en l'essuyant complètement. Ensuite, prenez une boucle d'inoculation stérile et placez-la manipuler vers le bas dans un flacon vide de 125 millilitres de sorte qu'il ne touche pas la surface du banc. Puis, à partir du réfrigérateur, rassemblez quatre assiettes de Mannitol Salt Agar, ou MSA, quatre assiettes d'agar eosin Methylène Blue, EMB, et huit tryptic Soy Agar, ou TSA, assiettes. Le milieu TSA est un milieu de croissance non sélectif qui sera utilisé pour les deux conditions environnementales différentes. Enfin, rassemblez vos cultures d'intérêt dans un support à tubes. Ici, Escherichia coli, Staphylococcus aureus, Staphylococcus epiderme, et Proteus vulgaris sera cultivé.

Pour commencer, allumez un brûleur Bunsen, qui sera utilisé pour stériliser les outils. Ensuite, placez une plaque MSA, une plaque EMB et deux plaques TSA à portée de main. Ensuite, sélectionnez l'une des cultures bactériennes. Vous inoculez ces quatre plaques avec la première culture. Avec votre main libre, prenez la boucle inoculante, puis stérilisez-la dans la flamme du brûleur jusqu'à ce qu'il brille orange pendant quelques secondes. Laisser la boucle refroidir dans l'air. Ensuite, ouvrez le tube de culture de bouillon et flammez rapidement l'ouverture. Trempez la boucle dans la culture, puis stries de l'organisme sur le premier quadrant de la première plaque. Puis la flamme stérilisez à nouveau la boucle et strie le deuxième quadrant. Répétez cette action de stérilisation des flammes, puis stries pour compléter les troisième et quatrième quadrants. Le triage de cette manière devrait donner des colonies isolées et permettre également la confirmation que la culture n'est pas contaminée.

Maintenant, remplacez le couvercle et étiquetez le bas de la plaque avec le nom de la bactérie, le type de média, la date et vos initiales. Ensuite, répétez le placage de strie en utilisant la même culture bactérienne pour chacune des trois plaques restantes en prenant soin de les étiqueter à chaque fois. Maintenant que la première culture a été strié, répétez ces étapes pour les autres bactéries pour obtenir une plaque MSA inoculée, une plaque embuée, et deux plaques TSA pour chaque espèce. Une fois que tous les organismes ont été transférés, flamme zeter la boucle une dernière fois.

Pour déterminer quels organismes peuvent se développer dans un environnement d'oxygène réduit, ouvrez un système de chambre à gaz scellé et placez un ensemble de quatre plaques de bactéries TSA à l'intérieur. Ensuite, placez un sachet anaérobie dans la chambre et scellez-le hermétiquement. Enfin, placez toutes les plaques, y compris celles à l'intérieur du système de chambre à gaz scellée, dans un incubateur de 37 degrés Celsius pendant la nuit. À l'avenir, vérifiez les plaques toutes les 24 à 48 heures pour donner aux colonies le temps de croître et de métaboliser les réactifs de l'indicateur.

Pour évaluer dans quelle mesure les différentes espèces bactériennes ont réagi à chaque condition de croissance, examinez d'abord les plaques pour la croissance et enregistrez quelles espèces ont pu produire des colonies sur chaque type de média et dans l'état anaérobie par rapport à l'aérobie. Notez la couleur des organismes qui poussent ainsi que la taille et la forme des colonies.

Le milieu d'agar de sel de mannitol est sélectif pour des organismes positifs de gramme qui peuvent survivre dans 6. 5% de chlorure de sodium. Dans cette expérience, cela signifiait que le gramme négatif E. coli et P. vulgaris n'a pas grandi en raison des fortes concentrations de sel. S. epiderme et S. aureus ont toutefois pu se développer, confirmant qu'ils sont gram positifs. En outre, il ya une nette différence entre les deux espèces parce que le S. aureus est capable de fermenter mannitol tournant l'indicateur rouge méthyle dans les médias à un jaune vif en raison des sous-produits acides de la fermentation. Cela n'a pas été vu dans le cas de S. epiderme.

Le milieu de l'OGE, d'autre part, est sélectif pour les organismes gram négatifs parce que l'éosine et les colorants bleus de méthylène sont toxiques pour les cellules gram positives. La membrane externe des bactéries gram négatives empêche ces colorants toxiques d'entrer dans les cellules, ce qui signifie qu'ils sont capables de croître. De plus, ce milieu indique si les espèces bactériennes présentes sont capables de fermenter le lactose. Ici, les colonies d'E. coli deviennent de couleur violet foncé, parfois avec un éclat métallique vert indiquant la fermentation. P. vulgaris pousse sur ce milieu mais ne fermente pas le lactose et apparaît ainsi un rose clair au violet d'être en présence de la teinture. Dans l'état anaérobie, les espèces bactériennes sur les médias TSA devrait encore croître, mais peut le faire très mal par rapport à ceux qui ont suffisamment d'oxygène. C'est parce qu'aucune des espèces d'essai ne sont obligatoires anaerobes.

Des expériences comme celle-ci pour enrichir l'environnement de croissance peuvent aider à favoriser et à isoler une espèce spécifique d'un échantillon mixte. Ils peuvent également aider à déterminer les conditions de croissance optimales pour différentes espèces bactériennes en laboratoire, ce qui facilite la poursuite des recherches.

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