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Transduction phage : Méthode de transfert de la résistance à l'ampicilline du donneur au receveur E. coli

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Les bactéries peuvent s'adapter rapidement à un environnement en évolution rapide en échangeant du matériel génétique et l'une des façons de le faire est par la transduction, l'échange de matériel génétique médié par des virus bactériens. Un bactériophage, souvent abrégé en phage, est un type de virus qui infecte les bactéries en se fixant d'abord à la surface de l'hôte, puis en injectant son ADN dans la cellule bactérienne. Il dégrade ensuite l'ADN de la cellule hôte et reproduit son génome viral, tout en détournant la machinerie de la cellule pour synthétiser de nombreuses copies de ses protéines. Ces protéines phages s'auto-assemblent et emballent les génomes de phage pour former la progéniture multiple. Cependant, en raison de la faible fidélité du mécanisme d'emballage de l'ADN, de temps en temps, le phage emballe des fragments d'ADN bactérien dans la capside phage. Après avoir induit la lyse de l'hôte, la progéniture phage sont libérés et, une fois qu'un tel phage infecte une autre cellule hôte, il transfère le fragment d'ADN de son hôte précédent. Cela peut ensuite se recombiner et s'intégrer en permanence dans le chromosome du nouvel hôte, ce qui permet de transférer des gènes entre les deux bactéries.

Pour effectuer la transduction de phage en laboratoire nécessite une souche de donneur qui contient un gène d'intérêt, une souche receveur qui n'en a pas, un phage qui peut infecter les souches, et une méthode pour sélectionner les bactéries transductées. Dans la plupart des cas, il s'agira d'un média sélectif de croissance solide qui soutient la croissance des bactéries cédées, mais inhibe la croissance des bactéries non cédées. Pour commencer, la souche de donneur qui contient le gène d'intérêt est cultivée dans un milieu de croissance liquide. Lorsque toutes les bactéries se divisent activement dans la phase de notation de leur croissance, la culture est inoculée avec le phage cible. Après trois à quatre heures d'incubation, lorsque presque toutes les bactéries ont lysé et libéré les particules de phage, le lysate phage donneur est inoculé dans une culture fraîchement cultivée de la souche bactérienne bénéficiaire. Après une brève incubation d'une heure, la culture devrait maintenant contenir un mélange de cellules bactériennes transductées et non transducées et cela est examiné pour les cellules transductées en répandant une fraction de la suspension sur un support de croissance solide sélectif approprié. Lors d'une incubation ultérieure, les cellules transducées devraient se développer et se multiplier pour produire des colonies visibles. Ces colonies peuvent ensuite être sélectionnées pour une analyse plus approfondie à l'aide d'une variété de méthodes pour confirmer davantage la transduction réussie, comme la pcR de la colonie, le séquençage de l'ADN ou le PCR quantitatif.

Avant de commencer la procédure, mettez tout équipement de protection individuelle approprié, y compris une blouse de laboratoire et des gants. Ensuite, stérilisez l'espace de travail avec 70% d'éthanol et essuyez la surface.

Après cela, préparer trois aliquots d'un millilitre de solution de sel LB. Maintenant, préparez une culture de souche de donneur en ajoutant 100 microlitres d'E. coli à un flacon conique de 15 millilitres contenant cinq millilitres de milieu de croissance LB avec 500 microgrammes d'ampicilline. Ensuite, cultivez la culture du jour au lendemain à 37 degrés Celsius avec l'aération et les secousses à 220 tr/min. Le lendemain, essuyez le dessus du banc avec 70% d'éthanol avant de retirer la culture de l'incubateur secouant. Ensuite, diluer la culture du jour au lendemain de 1 à 100 en ajoutant 10 microlitres de souche de donneur à 990 microlitres de LB frais complété s'est accompagné d'une solution de sel.

Laisser la dilution bactérienne se développer à 37 degrés Celsius pendant deux heures avec l'aération et secouer à 220 tr/min. Une fois que les cellules ont atteint la phase de journal précoce, retirer la culture de l'incubateur, ajouter 40 microlitres de phage P1 à la culture et incuber à nouveau. Continuer à surveiller les cellules pendant une à trois heures jusqu'à ce que la culture a lysed. Ensuite, ajouter 50 à 100 microlitres de chloroforme au lysate et mélanger par vortex. Ensuite, centrifuger le lysate pour enlever les débris et transférer le supernatant dans un tube frais. Ajoutez quelques gouttes de chloroforme au supernatant et conservez-le à quatre degrés Celsius pendant au plus un jour.

Pour commencer la procédure de transduction, obtenir une culture d'un millilitre de la souche du destinataire. Ensuite, transférer 100 microlitres de lysate de phage de donneur dans un tube de microcentrifuge de 1,5 millilitre et l'incuber à 37 degrés Celsius avec le bouchon ouvert pendant 30 minutes pour permettre à tout chloroforme restant de s'évaporer. Pendant que le phage lysate phage du donneur couve, granulez les cellules de la souche du receveur par centrifugation douce. Jetez le supernatant et resuspendre la pastille cellulaire en 300 microlitres de LB frais contenant 100 millimolaires de sulfate de magnésium et cinq chlorures de calcium millimolaires.

Ensuite, configurez la réaction de transduction en combinant 100 microlitres de la souche réceptrice et 100 microlitres du lysate phage du donneur dans un tube de microcentrifuge. Ensuite, configurez le contrôle négatif en combinant 100 microlitres de la souche récepteur et 100 microlitres de la LB avec du sulfate de magnésium et du chlorure de calcium. Après l'incubation, ajouter 200 microlitres d'un citrate de sodium molaire et un millilitre de LB dans les deux tubes, et mélanger en faisant doucement monter et descendre. Puis, après que les tubes ont été incubés pendant une heure, granulez doucement les cellules par centrifugation.

Après centrifuage, jeter le supernatant et resuspendre les cellules granulées dans 100 microlitres de LB avec 100 millimolar de sodium citrate. Vortex les solutions et pipette l'ensemble de l'échantillon transducé sur une plaque d'agar LB avec 1X ampicilline. Enfin, pipette le volume entier du mélange négatif de cellule de contrôle sur une plaque d'agar de LB sans ampicilline. Après avoir incubé les plaques pendant la nuit à 37 degrés Celsius, utilisez une pointe de pipette stérile pour cueillir trois à quatre colonies de la plaque de transduction et les stries sur une nouvelle plaque d'agar LB contenant 1X ampicilline et 100 microlitres d'un citrate de sodium molaire. Répétez cette méthode de placage pour le contrôle négatif sur une autre plaque d'agar LB contenant seulement 100 microlitres d'un citrate de sodium molaire. Ensuite, incuber les plaques à 37 degrés Celsius pendant la nuit pour permettre aux colonies exemptes de phage de se développer.

Le lendemain, essuyez le dessus du banc avec 70 % d'éthanol avant de retirer vos assiettes de l'incubateur. À l'aide d'une pointe de pipette stérile, choisissez trois colonies de la plaque de transduction et ajoutez-les chacune à un tube séparé contenant cinq millilitres de support LB. Ensuite, sélectionnez trois colonies de la plaque de contrôle négative et ajoutez-les à un autre tube contenant cinq millilitres de support LB. Cultivez les cultures pendant la nuit à 37 degrés Celsius avec l'aération et les secousses à 220 tr/min. Après avoir stérilisé le dessus du banc comme nous l'avons déjà démontré, utilisez un kit de miniprep d'ADN pour isoler l'ADN de 4,5 millilitres de chaque culture selon les instructions du fabricant. Ensuite, élichez l'ADN avec 35 microlitres d'eau sans nucléarité et mesurez la concentration résultante par spectrophotomètre de laboratoire. Enfin, préparer les stocks de glycérol en ajoutant les 0,5 millilitres restants des deux solutions bactériennes à 0,5 millilitres de 100% de glycérol.

Pour confirmer la transduction, préparez d'abord deux mélanges de maître qPCR pour 24 réactions qPCR. Pour le premier mix maître, ajouter 150 microlitres de mélange tampon qPCR à un tube microcentrifuge et 12 microlitres chacun d'une amorce avant et inverse conçue pour amplifier le gène de résistance à l'ampicilline. Ensuite, préparez un deuxième mix maître qPCR en ajoutant 150 microlitres de mélange maître qPCR à un tube microcentrifuge, puis en ajoutant 12 microlitres chacun d'une amorce avant et d'une amorce inversée conçue pour amplifier un gène d'entretien ménager.

Pour chaque réaction qPCR, combinez 100 microgrammes d'ADN expérimental de chaque réaction avec 14,5 microlitres de mix maître qPCR. Maintenant, préparez les réactions restantes comme précédemment démontré. Transférer les réactions à un thermocycleur préchauffé à 94 degrés Celsius, puis lancer le programme. Enfin, utilisez les valeurs de quantification du cycle, ou Cq, générées par qPCR pour calculer l'efficacité de transduction normalisée du gène de résistance à l'ampicilline.

Les valeurs de la quantitation du cycle, ou Cq, pour les gènes d'intérêt ont été compilées pour chacun des témoins négatifs et des échantillons transductés. Les faibles valeurs cqides, généralement inférieures à 29 cycles, comme les échantillons transducés dans cet exemple indiquent des quantités élevées de la séquence cible.

Un gène d'entretien ménager, également compilé ici, est utilisé comme un contrôle de chargement pour normaliser la quantité d'ADN dans chaque réaction et comme un contrôle positif pour s'assurer que le qPCR fonctionne. Si les mêmes quantités du gène d'entretien ménager sont chargées, on le trouve relativement au même rythme dans chaque échantillon.

Ensuite, pour calculer la valeur delta Cq pour chaque échantillon, soustrayez la valeur Cq du gène d'entretien ménager pour chaque échantillon de la valeur Cq de son gène cible correspondant. Par exemple, le delta Cq du premier contrôle négatif est de 13,54. Ensuite, utilisez cette valeur pour calculer l'efficacité de transduction normalisée de chaque échantillon à l'aide de la formule indiquée ici. Enfin, l'efficacité moyenne de transduction normalisée pour chaque groupe d'échantillons peut être calculée.

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