Encyclopedia of Experiments: Biology
A subscription to JoVE is required to view this content.
You will only be able to see the first 20 seconds.
Transcript
Please note that all translations are automatically generated.
- Quando os embriões injetados se desenvolverem em adultos G0, cruze todas as moscas individuais para obter estoques de balanceador adequados para expandir as linhas editadas potenciais do F1 CRISPR e ser capaz de rastrear a herança da modificação genômica. Em seguida, cruze os machos únicos da F1 escolhidos aleatoriamente para fêmeas balanceadoras adequadas para poder recuperar a prole se um macho F1 for positivo para a mutação.
Para extrair DNA genômico, esmague a mosca com uma ponta de pipeta contendo tampão de extração. Uma vez que o tecido é quebrado, ejete o líquido. O tampão de extração contém proteinase K, uma enzima que digere proteínas na amostra e é inativada por alto calor.
Agora que o DNA é acessível, proceda à triagem pcr. Por exemplo, use primers projetados para amplificar uma região que inclua a nova sequência. Somente na presença da modificação será amplificado o segundo primer e um produto PCR. No exemplo, veremos moscas sendo criadas e rastreadas pelo PCR para inserção de uma sequência de transativação substituindo o primeiro exon do gene sem ramificações.
- Quando os embriões nos-Cas9 injetados anteriormente com a expressão guia RNA plasmid e o doador substituto se desenvolvem em adultos, cruzar G0 voa individualmente para equilibrar moscas de uma linha apropriada para o alelo-alvo. Anesthetize a prole F1 de cada cruz G0 em uma almofada de dióxido de carbono e escolha aleatoriamente de 10 a 20 machos sob um microscópio estéreo. Individualmente cruze cada macho selecionado para uma fêmea balanceadora de uma linha apropriada para o alelo-alvo.
Quando as larvas F2 chocarem, escolha o pai F1 de cada cruz. Extraia DNA genômico esmagando cada mosca por 10 a 15 segundos com uma ponta de pipeta contendo 50 microliters de tampão de esguicho sem dispensar o buffer. Em seguida, dispense o buffer restante no tubo e misture bem.
Incubar a 37 graus Celsius por 20 a 30 minutos. Após a incubação, coloque os tubos em bloco de calor de 95 graus Celsius por 1 a 2 minutos para inativar a proteína K. Depois de girar para baixo por 5 minutos a 10.000 vezes g, armazene a preparação a 4 graus Celsius para análise suplementar de PCR.
Execute telas baseadas em PCR de três etapas usando primers para frente 1 e vertê-los 1 para a tela para a existência da inserção ou substituição. Execute PCR usando primers para frente 2 e 2 primers invertidos para verificar a inserção ou substituição de três regiões primos. Executar PCR usando primers M13F e reverso 3 para verificar o HDR de extremidade.
- Mantenha as linhas de voo com o HDR de extremidades confirmado e estabeleça estoques de equilíbrio da geração F2. Fora cruze as moscas do balanceador novamente para remover quaisquer mutações não intencionais em outros cromossomos.
