Genomik Modifikasyonların Taranması: Drosophila'da CRISPR Tarafından Üretilen Mutantları Tanımlama Yöntemi

- Enjekte edilen embriyolar G0 yetişkinlerine geliştiğinde, potansiyel F1 CRISPR düzenlenmiş çizgilerini genişletmek ve genomik modifikasyonun kalıtımını izleyebilmek için tüm bireysel sinekleri uygun dengeleyici stoklara geçin. Daha sonra, rastgele seçilen F1 tek erkeklerini, bir F1 erkeği mutasyon için pozitifse yavruları kurtarabilmek için uygun dengeleyici dişilere çaprazlayın.

Genomik DNA'yı çıkarmak için, sineği ekstraksiyon tamponu içeren bir pipet ucuyla ezin. Doku parçalandıktan sonra sıvıyı dışarı çıkarın. Ekstraksiyon tamponu, numunedeki proteinleri sindiren ve yüksek ısı tarafından inaktive edilen bir enzim olan proteinaz K içerir.

Dna'ya erişilebileceğine göre, PCR taramasına geçin. Örneğin, yeni diziyi içeren bir bölgeyi güçlendirmek için tasarlanmış astarları kullanın.

- Daha önce hem kılavuz RNA ekspresyon plazmidi hem de yedek donör ile enjekte edilen nos-Cas9 embriyoları yetişkinlere dönüştüğünde, çapraz G0, hedeflenen aleğe uygun bir çizgiden dengeleyici sineklere ayrı ayrı uçar. F1 yavrularını her bir G0 çaprazından bir karbondioksit pedi üzerinde uyuşturun ve stereo mikroskop altında rastgele 10 ila 20 erkek seçin. Seçilen her erkeği hedeflenen aleğe uygun bir çizgiden bir dengeleyici dişiye tek tek çarpın.

F2 larvaları yumurtadan çıktığında, her haçtan F1 babasını seçin. Her bir sineği tamponu dağıtmadan 50 mikrolitrelik ezme tamponu içeren bir pipet ucuyla 10 ila 15 saniye ezerek genomik DNA'yı çıkarın.

37 santigrat derecede 20 ila 30 dakika kuluçkaya bırakın. Kuluçkayı takiben, proteinaz K.'yi devre dışı bırakmak için tüpleri 95 santigrat derece ısı bloğuna 1 ila 2 dakika yerleştirin.

Ekleme veya değiştirmenin varlığını taramak için astarları ileri 1 ve ters 1 kullanarak üç adımlı PCR tabanlı ekranlar gerçekleştirin.

- Uçuş hatlarını onaylanmış uçucu HDR ile tutun ve F2 neslinden denge stokları oluşturun.