Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Encyclopedia of Experiments
Encyclopedia of Experiments: Biology

A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.

Telle kolonidannende enheter (CFUer)

 
Click here for the English version

Telle kolonidannende enheter (CFUer): Kvantifisere bakterier fra fluelegemer

Article

Transcript

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the English version.

- Samle først fluer ønsket utviklingsstadium og legg dem i et sterilt rør. For å telle bare den indre mikrobiota, steriliser utsiden av fluene ved å senke dem ned i 70% etanol. For å måle både den indre og eksterne mikrobiota, hopp over dette steriliseringstrinnet. Deretter sliper du fluene i et lite volum bakterielle vekstmedier ved hjelp av keramiske perler og en vevshomogenisator, eller manuelt med en pestle.

Du bør ha en homogen blanding som inneholder bakterier som du kan kultur. Ta opp volumet av homogenatet ved hjelp av flytende bakterielt medium. Utfør serielle fortynninger av homogenatet og plate et konstant volum av disse fortynningeneriktig solid vekstmedium for bakteriene dine. Etter hvert som bakteriene vokser, vil kolonier dannes platen. Finn fortynning som har et område 10 til 100 kolonier for å bestemme koloniformingsenhetene, eller CFU, av prøven.

I eksempelprotokollen vil vi inokulere sterile fluer med en gnotobiotisk eller definert bakteriekultur og samle og måle CFUer.

- Bruk filtertips til å overføre 100 mikroliter av nattvekst til et sterilt mikrofugerør. Deretter overfører du 200 mikroliter av hver kultur til en 96-brønnsplate. Fjern prøvene fra biosikkerhetsskapet og sentrifuger dem til pelletsbakteriene. Etter å ha laget en-, to- og fire ganger fortynning, mål den optiske tettheten eller OD600 en multi-brønnplateavlesning.

Etter å ha fått OD600, fjern supernatanten med en pipettespiss og bruk fersk mMRS til å re-suspendere pelletsen. Bland de fortynnede bakteriestammene i like forhold for å skape en flerartscocktail. Overfør 50 mikroliter av cocktailen til de koniske rørene som inneholder det sterile kostholdet og dechorionated eggene. Pass å legge til bakteriene etter eggoverføringen for å forhindre forurensning mellom hetteglass.

For å måle kolonidannende enheter eller CFUer, overfør fem fluer til et 1,7 milliliter mikrofugerør som inneholder 125 mikroliter keramiske perler og 125 mikroliter mMRS buljong. Homogeniser fluene ved hjelp av en vevshomogenisator. Det bør ikke være noen hele deler flyet gjenstår. Deretter fortynner homogenatet med 875 mikroliter mMRS, virvel homogenatet i fem sekunder og pipette 120 mikroliter inn i den første brønnen av en mikrotiterplate.

Fjern 10 mikroliter fra den første brønnen og legg den til den andre brønnen som inneholder 70 mikroliter MRS. Bland innholdet i den andre brønnen grundig. og bland grundig. Overfør 10 mikroliter av hver fortynning til en mMRS-plate. Bland tallerkenen litt for å spre fortynning flere millimeter ned agarens overflate og la væsken tørke før du flytter platen. Fjern platene fra inkubatoren når distinkte individuelle kolonier er synlige og tell dem fra en fortynning med 10 til 100 isolerte kolonier. Til slutt beregner du CFU per flue.

Tags

Tom verdi Problem
Read Article

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter