Encyclopedia of Experiments: Biology
A subscription to JoVE is required to view this content.
You will only be able to see the first 20 seconds.
Transcript
Please note that all translations are automatically generated.
- För att utföra kalciumavbildning in vivo i Drosophila nervsystemet, rikta uttrycket av en genetiskt kodad kalciumindikator, såsom GCaMP, till nervceller av intresse.
GCaMP är ett fusionsprotein där förbättrat grönt fluorescerande protein, eller EGFP, modifieras och smälts till M13-fragmentet av myosinljuskedjan vid N-ändstationen, och till kalciumbindande protein, kalmodulin, vid C-ändstationen. Kalcium binder till kalmodulin, utlöser konformationsförändringar i GCaMP, vilket orsakar en ökning av proteinets fluorescens.
För att avbilda förändringar i GCaMP fluorescens som en proxy för neuronal aktivitet in vivo, exponera regionen i nervsystemet med förväntad aktivitet. Sedan, använd ett fluorescerande mikroskop som kan fånga GCaMP-dynamik och är utrustad med en stimulansleveransinställning.
I exempelprotokollet kommer vi att se GCaMP funktionell avbildning användas för att visualisera svar i hjärnans svampkroppar under lukt associativ inlärning.
- För visualisering av de GFP-baserade kalciumindikatorerna, finjustera lasern i ett multifotonmikroskop utrustat med en infraröd laser och ett mål för vattensänkning. installeras på ett vibrationsisolerat bord, till en excitationsvåglängd på 920 nanometer, och installera ett GFP-bandpassfilter. storlek till 512 gånger 512 pixlar och välj den region som ska skannas, med hänsyn till den beräknade skanningstiden för varje bildruta för att uppnå en bildhastighet på minst 4 Hertz.
För lukt-framkallat kalcium transient visualisering, initiera ett förprogrammerat makropaket som kan länka bildförvärv programvara och lukt leverans programmet och börja mätningen i mikroskop programvara i 6,25 sekunder för att fastställa ett F0 baslinjevärde. I lukttillförselsystemet, leverera en 2,5 sekunders luktstimulans, indikerad här genom belysning av lysdioder, utlöst av öppning och stängning av specifika luktkoppventiler, följt av 12,5 sekunders inspelning i slutet av luktkompensationen. Sedan upprepa leveransen för en andra och tredje lukt på samma sätt.
Om du vill utföra associativ konditionering i den här installationen använder du det datorstyrda lukttillförselsystemet för att presentera den konditionerade stimulansen plus lukten i 60 sekunder. tillsammans med 12 90-volts elektriska stötar. Efter en 60 sekunders paus, presentera tillståndsstimulansen minus lukt ensam i 60 sekunder utan elektrisk stöt. Mät de efterträningsluktade kalciumtransienterna igen genom att upprepa luktstimuleringsprotokollet före träningen 3 minuter efter avslutad träningsfas. Spara sedan bildfilerna i lämpligt format för senare bildanalys.
