C. elegans Gonad Extrusion: Eine schnelle Dissektionstechnik

- In einem Rohr mit M9-Puffer, sammeln Sie bis zu 150 Hermaphrodit-Würmer im gewünschten Entwicklungsstadium. Entfernen Sie Bakterien aus den Würmern, indem Sie mit M9-Puffer waschen und die Probe zentrifugieren.

Sehen Sie sich das Rohr unter einem Sezieren Mikroskop beim Entfernen des Überstandes an, um den Verlust der Probe zu verhindern. Übertragen Sie die Würmer in eine Glasschale mit einem minimalen Volumen von M9-Puffer. Fügen Sie Levamisol hinzu, um die Würmer zu anästhesieren.

Suchen Sie den Kopf des Wurms und den Rachen, oder Vorgut, das zwei birnenförmige Strukturen enthält. Verwendet zwei Nadeln, um den Wurm hinter dem Rachen zu schneiden. Stellen Sie sicher, dass Sie die Sezieren schnell abschließen, um zu vermeiden, dass das Gewebe beeinträchtigt.

Sobald die Nagelhaut gestört ist, werden die beiden Gonadenarme durch den inneren Druck des Wurms extrudiert oder aus dem Körper geschoben.

In diesem Beispiel werden wir Gonaden von erwachsenen Würmern für die Immunfluoreszenzanalyse sezieren.

- 100 bis 150 Würmer im gewünschten Entwicklungsstadium pflücken und in einem 1,5-Milliliter-Mikrozentrifugenrohr mit 100 MikroliterM9-Puffer sammeln. Füllen Sie dann das Mikrozentrifugenrohr mit 900 weiteren Mikrolitern M9-Puffer und zentrifugieren Sie es bei 1.000 mal g für 1 Minute bei Raumtemperatur.

Entfernen Sie unter einem Sezierendes Mikroskop vorsichtig 900 Mikroliter des M9-Puffers. Wiederholen Sie dann die Wäsche zwei weitere Male, um die meisten der angeschlossenen Bakterien zu entfernen.

Als nächstes, mit einer 200-Mikroliter-Mikropipette Spitze mit einer verbreiterten Bohrung, übertragen Sie die Würmer in 100 Mikroliter M9 Puffer auf eine flache Boden glas uhrschale. Dann fügen Sie 1 bis 3 Mikroliter 0,1 Mol-Levamisol auf die Schale und wirbeln Sie es sanft. Jetzt befestigen Sie zwei 25-Spur-Nadeln an zwei Spritzen, um ein Trennwerkzeug für jede Hand zu machen.

Positionieren Sie unter einem Sezierendes Mikroskop jede Nadel unter und über jedem Wurm und machen Sie einen feinen Schnitt an jedem Wurm in der Nähe der zweiten Rachenkugel mit einer Schere wie Bewegung. Schneiden Sie alle Tiere mindestens einmal innerhalb von fünf Minuten, damit die Levamisole wirksam bleibt.

- Es ist sehr wichtig, dass die Zerlegung der Tiere in der Schale in weniger als fünf Minuten abgeschlossen ist.

- Falls ein extrudierter Gonaden nicht sichtbar ist, überspringen Sie einfach das Tier. Richtige extrudierte Gonaden sind hier sichtbar.