Encyclopedia of Experiments: Biology
A subscription to JoVE is required to view this content.
Transcript
Please note that all translations are automatically generated.
- Vid visualisering av lipiddroppar, de intracellulära lagringsorganellerna för neutrala lipider, börja med att tillsätta en tvättmedelslösning, till exempel en som innehåller Triton X-100, till provet.
Tillsätt sedan Nile Red i provet och skydda det från ljus, eftersom färgämnet är ljuskänsligt. Fixering gör det möjligt för färgämnet att komma åt lipiddroppar i hela djuret.
När Nile Red exponeras för polära lipider, såsom fosfolipider, är det i de högre röda våglängderna.
Använd därför den gröna kanalen i ett fluorescerande mikroskop, som kommer att samla in utsläppen av gulgultvåglängd, för att visualisera Nile Red-färgning av lipiddroppar i hela djuret.
- För att utföra Nile Red lipidfärgning, tallriksmaskar på nematodtillväxtmedium, eller NGM, sådd med sen stock OP50 E. coli, och odla maskarna vid 20 grader Celsius till tidigt L4-stadium. Tvätta maskarna med 1 milliliter PBST-lösning och överför maskfjädringen till ett 1,5 milliliter mikrofugerör.
Centrifugera maskarna vid 560 gånger gravitationen i en minut, ta sedan bort supernatanten och upprepa PBST-tvätten tills E. coli rensas från suspensionen.
- Tillsats av isopropanol är avgörande för korrekt permeabilisering av maskarna före färgning.
- Centrifugera maskarna vid 560 gånger gravitationen i en minut och ta bort supernatanten utan att störa maskpelleten.
- Det är viktigt att minimera ljusexponeringen under centrifugeringsstegen.
- Lägg nu till 600 mikroliter tidigare tillagad NR-arbetslösning i varje prov.
Efter inkubation, centrifugera maskarna och ta bort supernatanten. Tillsätt sedan 600 mikroliter PBST och inkubera proverna i mörkret i 30 minuter för att ta bort överskottet av NR-fläck.
