Dissociation à cellule unique de Caenorhabditis elegans: Une méthode pour isoler les cellules vivantes

- Commencez par des vers granulés lavés et ajoutez un tampon de lyse contenant du SDD, un détergent et du DDT, un agent réducteur. Cela décompose la cuticule protectrice du ver exposant le corps à la dissociation cellulaire. Évitez l’exposition prolongée au tampon de lyse afin de minimiser la lyse cellulaire et la mort.

Ensuite, retirez les reagents de lyse avec plusieurs lavages de tampon d’isolement froid. Il est important que ce tampon soit de l’osmolarité correcte pour empêcher la mort cellulaire. Utilisez une enzyme de protéase pour décomposer la cellule aux connexions cellulaires. Aidez le processus d’homogénéisation ainsi que l’énergie mécanique en pipetant le mélange contre la paroi du tube.

Ajouter des supports contenant du sérum pour arrêter la réaction enzymatique et les antibiotiques pour prévenir la contamination. Pellet et laver l’échantillon plusieurs fois pour enlever la plupart des débris.

Enfin, placez le tube sur la glace pour permettre la sédimentation par gravité. Les débris, y compris les restes de cuticule ou de touffes cellulaires, s’installeront, tandis que les cellules dissociées resteront suspendues dans la couche supérieure des médias. Ces cellules peuvent être utilisées pour la culture à court terme ou pour isoler des populations cellulaires spécifiques par FACS ou immunoprécipice.

Dans le protocole d’exemple, nous dissocierons les vers transgéniques exprimant GFP dans les neurones d’intérêt pour isoler et analyser ces cellules.

- Après avoir recueilli les animaux, centrifugez-les à 1 600 g pendant cinq minutes. Retirez tous les supernatants et suspendez les vers en 1 millilitre de m9 média. Transférez la suspension dans un tube de microcentrifugeuse de 1,5 millilitre.

Centrifugeuse à 1 600 g pendant cinq minutes pour granuler les vers. Ensuite, ajoutez 200 microlitres de tampon SDS-DDT et incubez à température ambiante pendant cinq minutes. Les vers devraient maintenant sembler froissés le long du corps s’ils sont vus au microscope léger.

Ensuite, ajoutez 800 microlitres de tampon d’isolement glacé et mélangez en faisant glisser doucement le tube. Centrifugeuse à 13 000 fois g et à 4 degrés Celsius pendant une minute pour granuler les vers. Retirez le supernatant et lavez avec 1 millilitre de tampon d’isolement.

Répétez cette centrifugation et lavez le processus un total de cinq fois, en vous assurant d’enlever soigneusement le tampon d’isolement à chaque fois. Après cela, ajouter 100 microlitres de mélange de protéase de Streptomyces griseus dissous dans le tampon d’isolement, à la pastille.

Incuber à température ambiante de 10 à 15 minutes. S’assurer d’appliquer une perturbation mécanique en faisant monter et descendre 60 à 70 fois avec la pointe micropipette de 200 microlitres contre le fond du tube. Pour déterminer le stade de digestion, retirez 1 à 5 microlitres du mélange de digestion, déposez-le sur une lame de verre et inspectez-le à l’aide d’un microscope à culture tissulaire.

Au bout de cinq à sept minutes, les fragments de vers devraient avoir une cuticule visiblement réduite et une boue de cellules sera facilement visible. Arrêtez la réaction en ajoutant 900 microlitres de L15 de Leibovitz disponibles dans le commerce, complétés par 10 % de FBS et de pénicilline-streptomycine.

Centrifugeuse à 10 000 fois g et à 4 degrés Celsius pendant 5 minutes pour granuler des fragments et des cellules isolées. Lavez les cellules granulées deux fois plus avec des médias froids complétés par L15 à l’aide de 1 millilitre de médias par lavage. Suspendez les cellules granulées en 1 millilitre de l15 multimédias complétés et laissez sur la glace pendant 30 minutes.

Ensuite, prenez la couche supérieure, qui est d’environ 700 à 800 microlitres, et transférez-la dans un tube de microcentrifugeuse. Utilisez un compteur cellulaire automatisé ou un hémocytomètre pour mesurer la densité cellulaire de 10 à 25 microlitres de cellules isolées.