Encyclopedia of Experiments: Biology
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- Para testar a preferência de temperatura das larvas de Drosophila, crie um gradiente de temperatura aquecendo um lado de uma placa de ensaio de alumínio e resfriando o outro. O alumínio tem alta condutividade térmica, o que significa que o calor é transferido de forma eficiente, criando um gradiente de temperatura linear estável.
Cubra todo o sistema para eliminar a interferência da luz brilhante e inicie o ensaio. Larvas distribuem através do gradiente, evitando zonas aversivas que são muito quentes ou muito frias, e se instalam em zonas de temperatura favorável. Este comportamento é chamado termotaxis. Para avaliar a preferência de temperatura das larvas, registo o número de animais em cada zona de temperatura.
No protocolo de exemplo, veremos como configurar um gradiente de temperatura de direção única entre 18 e 28 graus Celsius, e como as larvas são tratadas durante o ensaio.
- Para preparar um gradiente unidirecional, primeiro, crie um ambiente ambiente úmido para o ensaio. Coloque dois blocos de alumínio conectados a banhos de água separados em toalhas de papel molhados a 10 centímetros de distância. Os banhos de água precisam ser aquecidos com antecedência. Em seguida, faça 100 mililitros de 1% de agarose e adicione 25 mililitros a cada placa de ensaio em uma superfície nivelada.
Em seguida, para promover uma transferência eficiente de temperatura, preencha quaisquer lacunas entre os blocos de alumínio nas placas de ensaio com água fornecida de uma garrafa de spray. Agora, coloque as placas de ensaio nos blocos de alumínio e certifique-se de que as demarcações estão a 2 centímetros de cada borda para combinar exatamente com as bordas dos blocos de alumínio.
Em seguida, pulverize uma película de água na superfície das placas para que os géis não sequem. Em seguida, cubra o sistema com uma caixa de papelão para reduzir a evaporação e ajude a estabilizar a temperatura da superfície do gel. Aguarde de 5 a 10 minutos para permitir que a temperatura se equilibre. Em seguida, verifique a temperatura da superfície na placa em pelo menos 12 locais para garantir que haja uma temperatura uniforme por toda parte, dê ou leve 2 graus Celsius. Em seguida, substitua a tampa da caixa até que o ensaio seja realizado.
Primeiro, remova a caixa de papelão sobre o gel e verifique rapidamente a temperatura da superfície do gel. Se a superfície estiver seca, pulverize uma pequena quantidade de água na superfície. Se o gel estiver bom, então carregue de 100 a 200 larvas no centro de cada placa usando um pequeno pincel.
Após 10 a 30 minutos, remova a caixa de papelão e a tampa da microplaca. Em seguida, fotografe as placas de cima para registrar a posição das larvas. Coloque a caixa acima da câmera para evitar reflexo na superfície do gel. Para limpar a placa, aspire todas as larvas onde quer que elas possam ter espalhada.
Agora, calcule a distribuição percentual de larvas em cada região usando o software de análise de imagem. Faça linhas a cada 2 centímetros com base nas demarcações na placa de ensaio e conte o número de larvas em cada zona.
- Ao contar, ignore as larvas distribuídas em regiões de 0,5 centímetros de cada borda. A espessura do gel e as condições de temperatura não são uniformes perto da borda.
