C. Elegans Bevægelsessporing: En metode til vurdering af bevægelse i orme

- For at vurdere bevægelse i C. elegans skal du bruge et kamera til at registrere ormenes bevægelse på en agarplade, hvilket sikrer jævn belysning af pladen under optagelsen.

Placer flere kobberringe på en plade for samtidig at spore orme i hver ring. Dette gør det muligt at vurdere kontrol og forsøgsdyr, der skal udføres under identiske forhold, hvilket reducerer dag til dag variabilitet og giver mulighed for side om side sammenligninger.

I eksempelprotokollen vil vi se en demonstration af en bevægelsessporingsanalyse, der tester alkoholens virkninger på ormens bevægelseshastighed.

- Til at begynde med, tage to minutter eller mindre at overføre 10 orme fra hver eksperimentel gruppe til midten af en kobberring på en akklimatisering plade. Dette er en plade uden ethanol. Undgå at overføre mad med orme, da det vil reducere deres bevægelse. Også undgå at beskadige agar overflade, fordi ormene vil grave.

Lad hver akklimatiseringsplade inkubere ved stuetemperatur i 30 minutter. Overfør derefter ormene til analysepladen efter den ordre, der bruges til at placere ormene på akklimatiseringspladen.

- Den hastighed, hvormed dyrene overføres på dette trin, er meget vigtig, fordi de overførte dyr vil blive udsat for ethanol længere. Så det er en god ide at rotere, hvilke stammer der først placeres på pladen på tværs af eksperimentelle replikater.

- Et mikroskop med høj opløsning videokamera er forpligtet til at filme orme nu. Selv belysning, såsom fra en tre-tommer firkantet baggrundsbelysning, er afgørende for analysen. Derefter, for at opretholde kontrast, billede pladen medier side op.

Forbered billedanalysesoftwaren til hentning af 120-billeder, 12-bit, gråtonefilm og time-lapse-film i én ramme pr. sekund. Hvis du vil reducere outputfilens størrelse, samtidig med at du bevarer tilstrækkelig billedopløsning, skal du bruge en to efter to-placeringstilstand.

Optag nu to minutters film fra hver plade, 10 minutter efter at de sidste orme blev placeret på den plade. Lav derefter en anden to minutters optagelse, 30 minutter efter orme blev placeret på pladen. Til denne demonstration bruges Image-Pro Plus-software, da en lang række anden software kan tilpasses teknikken.

Anvend først et filter på de billeder, der samkopierer baggrunden og forbedrer kontrasten i ormeobjekterne.

Analyser nu dyrenes bevægelse i hver ring separat med et cirkulært område af interesse, der overlapper kobberringen.

Brug knappen Sporingsindstillinger i vinduet Sporingsdatatabel til at tillade, at bestemte spor udelades, og til at begrænse eventuelle eksperimentelle artefakter.

Indstil den samlede mindste sporlængde til 400 mikron, og indstil den fremherskende bevægelsestype til Kaotisk.

Hvis du vil starte sporingsprocessen, skal du først klikke på funktionsknappen Find alle spor automatisk.

Anvend nu et størrelsesfilter for at udelade objekter, der er større eller mindre end en enkelt orm. Gå til menuen Målpunkt, og vælg derefter undermenuen Måling.

Udfyld nu sporingsprocessen ved at klikke på Fortsæt i sporingsdialogboksen.

Derefter skal du beregne hastigheden af hver orm ved at beregne den tilbagelagte afstand mellem hver ramme eller hvert sekund og oprette en gennemsnitlig hastighed for sporene i hver population.