C. elegans Hareket Takibi: Solucanlarda Locomotion'ı Değerlendirmek için Bir Yöntem

- C. elegans'taki hareketliliği değerlendirmek için, solucanların hareketini bir agar plakasına kaydetmek için bir kamera kullanın, kayıt sırasında plakanın eşit şekilde aydınlatılmasını sağlayın. Solucanların plaka etrafındaki hareketini kısıtlamak için bakır halkalar kullanın. Bakır C. eleganlara karşıdır, bu nedenle solucanlar halkaların içinde toplanır.

Her halkadaki solucanları aynı anda izlemek için bir tabağa birkaç bakır halka yerleştirin. Bu, kontrol ve deney hayvanlarının aynı koşullar altında değerlendirilmesini sağlar, günden güne değişkenliği azaltır ve yan yana karşılaştırmalara izin verir. Solucanların hareketini belirlenen zaman aralıkları boyunca kaydedin ve hareket hızı ve kat edilen mesafe gibi lokomotif davranışının özelliklerini analiz etmek için bilgisayar yazılımını kullanın.

Örnek protokolde, alkolün solucanın hareket hızı üzerindeki etkilerini test eden bir hareket izleme testi gösterisi göreceğiz.

- Başlamak için, her deney grubundan 10 solucanı bir alışma plakasındaki bakır halkanın ortasına aktarmak için iki dakika veya daha az zaman ayırın. Bu etanol olmayan bir tabaktır. Yiyecekleri solucanlarla aktarmaktan kaçının, çünkü solucanlar yuva yapacaktır. Ayrıca ağar yüzeyine zarar vermekten kaçının. Plakaya yükleme süresini kaydedin ve solucanların her tabağa transferini iki dakikadan fazla hareket ettirilediğinden emin olun, böylece her plaka uygun zaman aralığında ayrı ayrı filme alınabilir.

Her bir alışma plakasının oda sıcaklığında 30 dakika kuluçkaya yatmasına izin verin. Daha sonra, solucanları alışma plakasına yerleştirmek için kullanılan sırayı izleyerek solucanları test plakasına aktarın.

- Hayvanların bu adımda transfer edilme hızı çok önemlidir, çünkü aktarılan hayvanlar etanollere daha uzun süre maruz kalacaktır. Bu nedenle, plakaya ilk olarak hangi suşların yerleştirildiğini deneysel kopyalar arasında döndürmek iyi bir fikirdir.

- Solucanları şimdi çekmek için yüksek çözünürlüklü video kameraya sahip bir mikroskop gereklidir. Üç inç kare arka ışıktan olduğu gibi aydınlatma bile analiz için hayati önem taşır.

Görüntü analizi yazılımını saniyede bir karede 120 kare, 12 bit, gri tonlamalı, hızlandırılmış filmler yakalayacak şekilde hazırlayın.

Şimdi her plakadan iki dakikalık filmler kaydedin, son solucanlar bu tabağa yerleştirildikten 10 dakika sonra. Sonra ikinci bir iki dakikalık kayıt yapın, solucanlar tabağa yerleştirildikten 30 dakika sonra. Bu gösteri için Image-Pro Plus yazılımı kullanılır, çünkü çok çeşitli diğer yazılımlar tekniğe uyarlanabilir. Filmleri iki dakikalık bölümler olarak analiz edin.

Önce arka planı düzleyen ve solucan nesnelerinin kontrastını artıran görüntülere bir filtre uygulayın.

Şimdi, her halkadaki hayvanların hareketlerini bakır halkayla örtüşen dairesel bir ilgi alanıyla ayrı ayrı analiz edin.

Veri Tablosunu İzleme penceresinde, belirli parçaların dışlanmasına izin vermek ve deneysel yapıtları sınırlamak için İzleme Seçenekleri düğmesini kullanın. Otomatik İzleme sekmesinin altında, izleme parametrelerini kare başına 400 mikron hız sınırına ayarlayın.

Minimum Toplam parça uzunluğunu 400 mikron olarak ayarlayın ve Baskın Hareket Türünü Kaotik olarak ayarlayın.

Şimdi, izleme işlemini başlatmak için önce Tüm parçaları otomatik olarak bul işlev düğmesini tıklatın. Bu, Sayı/Boyut Seçenekleri iletişim kutusunu ve İzleme İletişim Kutusunu getirir.

Şimdi, tek bir solucandan daha büyük veya daha küçük nesneleri dışlamak için bir boyut filtresi uygulayın. Ölçü menüsüne gidin ve Ölçüm alt menüsünü seçin. Bu, Sayı/Boyut seçenekleri iletişim kutusunu açar.

Şimdi, izleme iletişim kutusunda Devam'ı tıklatarak izleme işlemini tamamlayın. Çıktının film görüntüleriyle birlikte iz olup olmadığını iki kez denetleyin. Filtre uygulamak için açık bir neden olmadıkça her solucanın temsil edildiğine emin olun.

Ardından, her kare veya her saniye arasında kat edilen mesafeyi ortalama alarak her solucanın hızını hesaplayın ve her popülasyondaki izler için ortalama bir hız oluşturun.