Encyclopedia of Experiments: Biology
A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.
Transcript
Please note that all translations are automatically generated.
- Placer en transgen orm udtrykke GCaMP - en calcium sensing protein - i en billeddannelse kammer sammen med bakteriel mad til ormen. Derefter forsegle skålen med låget og laboratoriet film for at forhindre fordampning. Se det under et sammensat mikroskop udstyret til bred felt epifluorescens. Optag tid bortfalder billeder af orme til at spore deres adfærd og fange fluorescens ved hjælp af billedbehandling software.
Transgene orme udtrykker et GCaMP-sensorprotein under kontrol af en promotor, der driver GCaMP-udtrykket i en bestemt neuron. Når denne neuron aktiveres, affyrer den et handlingspotentiale, som depolariserer plasmamembranen. Ved depolisering åbner spændings-gated calciumkanaler i plasmamembranen. Dette forårsager en tilstrømning af calciumioner til cellen, hvilket resulterer i neuronal excitation.
GCaMP i ophidset neuron binder calcium ioner. Dette forårsager GCaMP at fluorescere, når ormene er afbildet med en lav intensitet fluorescens excitation lys. I eksemplet protokol, vil vi bruge calcium billeddannelse til at visualisere AVA interneuron aktivitet i transgene C. elegans i agarose mikrochambers.
- Calciumbilleddannelse udføres på et sammensat mikroskop, der er udstyret til epifluorescens i det brede felt.
Kør en burst-film i 24 timer, der billederer hver orm hvert 15. til 30.
Til visuel datainspektion skal du bruge et falsk farvekort til at øge synligheden af små ændringer i fluorescensintensiteten.
