Etiquetado linaje de células de pez cebra con láser Uncagable fluoresceína Dextran

El objetivo general de este procedimiento es etiquetar el linaje de las células en un embrión de pez cebra. Esto se logra sintetizando primero fluoresceína en jaula e inyectándola en los embriones de pez cebra. A continuación, los embriones se montan en agarro para que las células que se van a marcar sean accesibles.

A continuación, se utiliza un láser UV para activar la fluoresceína enjaulada en células seleccionadas del embrión. Finalmente, los embriones se cosechan después de que se han desarrollado hasta la etapa deseada y las células marcadas se detectan en relación con los marcadores de linajes particulares. En última instancia, se pueden obtener resultados que muestran el destino de las células seleccionadas en los embriones a través de fotodesjaulamiento y microscopía inmunofluorescente.

La principal ventaja de esta técnica sobre las técnicas existentes, como la fotoconversión de Cade, es que la inmunofluorescencia multicolor puede detectar fluoresceína no enjaulada, además de otros anticuerpos específicos de ligado celular. Para inyectar fluoresceína dextrano en jaulas en embriones de pez cebra, primero sinténtelo y prepare el 1% de peso por volumen. Almacene alícuotas de acuerdo con el protocolo escrito adjunto.

A continuación, alícuota diluyente, de uno a cinco o de uno a 10 en cloruro de potasio 0,2 molar. A continuación, inyecte de 0,5 a un nanolitro de solución de fluoresceína enjaulada en la yema de embriones en etapa de célula. Utilizando un inyector de presión una vez inyectados, las nidadas de embriones deben mantenerse en la oscuridad a 28,5 grados centígrados para reducir el desenjaulamiento inespecífico en la etapa de desarrollo deseada.

Retire manualmente el choon de los embriones, anestesiar los embriones en 4%trica para montar los embriones equilibrados, 0.8%aros derretidos en un bloque de calor de 50 grados Celsius durante al menos 15 minutos. A continuación, enfríe el tubo en su mano durante aproximadamente 30 segundos Antes de añadir embriones con una pipeta de vidrio, extraiga un embrión en una cantidad mínima de agua y suéltelo en el aros. Pipetear el embrión del tubo junto con aproximadamente 50 microlitros de aros y expulsar el contenido al centro de una placa de Petri de 35 milímetros por 10 milímetros.

Con ayuda de un hilo de plástico, oriente rápidamente el embrión con las células a desenjaular hacia arriba. Deje que los aros se solidifiquen por completo y llenen el plato. Dos tercios llenos con agua de huevo que contiene 4% de trica y 0.003% de PTU mantienen los embriones en una caja ligera y hermética hasta que estén en jaula.

Para realizar el láser en la jaula de fluoresceína dextrano, use un microscopio compuesto con una lente de objetivo de inmersión en agua de 40x. Utilizamos un láser de instrumentos fotónicos con una celda de tinte de 365 nanómetros y un espejo dicroico dividido al 70% 30% antes de enjaular. El láser debe estar a la par focal con el objetivo y atenuado a la potencia adecuada para enfocar el láser.

Coloque una diapositiva de vidrio espejado debajo del objetivo y enfóquelo hasta que se vean los arañazos en la diapositiva. Ajuste el atenuador láser hasta que el láser produzca un rasguño claramente visible en el espejo con un solo pulso, ajuste el enfoque del objetivo hacia arriba y hacia abajo. Si el láser puede producir un rasguño cuando el objetivo está desenfocado, ajuste el enfoque del láser un cuarto.

Gira hacia arriba o hacia abajo. Repita hasta que el láser pueda rayar el espejo. Solo cuando el objetivo esté enfocado, coloque el embrión montado debajo del objetivo y concéntrese en el área que se va a desenjaular para desenjaular.

Concéntrese en una celda de interés y póltela de 10 a 20 veces a dos o tres hercios. Después de desenjaular. Libere el embrión pelando los aeros con pinzas y poniéndolos en agua de huevo que contenga 0.003% de embriones PTU Fix en fijador de anticuerpos durante dos a cuatro horas a temperatura ambiente o durante la noche a cuatro grados centígrados.

Retire el fijador y reemplácelo con metanol 100%. Incubar durante 10 minutos a temperatura ambiente. Luego retire el metanol y reemplácelo con metanol 100% fresco.

Almacene los embriones en metanol a menos 20 grados centígrados durante al menos 30 minutos. Puede almacenarse en metanol hasta dos semanas antes de que los epítopos comiencen a degradarse. Rehidratar los embriones con lavados de cinco minutos a temperatura ambiente de 75%Metanol 25%uno x solución salina tamponada con fosfato con 0,1%tween 20, 50%metanol 50%un XPBS tween 20, luego 25%metanol, 75%un XPBS tween 20 lavar tres veces durante cinco minutos en un XPBS tween 20.

Si los embriones tienen más de 24 horas de edad, perme con 10 microgramos por mililitro. El tiempo de permeación de la proteinasa K en un XPBS entre 20 años depende de la etapa embrionaria. Cinco minutos en proteasa K son suficientes.

Si los embriones están entre 24 y 48 horas después de la fertilización, es posible que se requiera más tiempo para las larvas más viejas. Vuelva a fijar un fijador de anticuerpos durante 20 minutos a temperatura ambiente. Lave los embriones cinco veces durante cinco minutos en un XPBS tween 20 a temperatura ambiente.

Luego incube en solución en bloque durante una o dos horas a temperatura ambiente. Diluir los anticuerpos primarios en una solución bloqueante. A continuación, incubar los embriones durante la noche a cuatro grados centígrados en una solución que contenga anticuerpos primarios a la mañana siguiente, mientras se lavan los embriones cuatro veces en un XPBS tritton X 100 anticuerpos secundarios diluidos marcados con fluorescencia en solución de bloqueo.

Incubar los embriones durante la noche a cuatro grados centígrados en una solución que contenga anticuerpos secundarios. Después de lavar cuatro veces en un XPBS Triton X 100, limpie los embriones con 50%glicerol 50%one XPBS durante al menos dos horas a temperatura ambiente. Luego retire la mezcla de glicerol PBS y agregue la incubación de glicerol al 100% durante la noche a cuatro grados centígrados.

Los resultados de la representación para las larvas de control y foto-no enjauladas se muestran en forma de proyecciones confocales. Los embriones de control fueron inyectados con fluoresceína en jaula, pero no se sometieron a fotodesenjaulamiento a las 48 horas después de la fertilización. El embrión control exhibe marcaje de GFP en el complejo pineal.

Se detecta algo de marcaje de fondo punteado, pero no se detecta una acumulación localizada de fluoresceína marcada. Los embriones fotono enjaulados muestran una clara acumulación de fluoresceína no enjaulada en algunas de las células marcadas con GFP. Estos son los descendientes de las células objetivo de la foto en jaula 24 horas antes con pequeñas modificaciones.

Este procedimiento se puede utilizar para marcar el linaje de casi cualquier tejido en el embrión de pez cebra antes de las 48 horas posteriores a la fertilización.