Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Science Education
Basic Methods in Cellular and Molecular Biology

A subscription to JoVE is required to view this content.
You will only be able to see the first 20 seconds.

 
Click here for the English version

שיבוט מולקולרי

Overview

שיבוט מולקולרי הוא מערכת של שיטות, המשמשות להחדרת דנ"א רקומביננטי לווקטור - נשא של מולקולות דנ"א שישכפלו שברי דנ"א רקומביננטיים באורגניזמים מארחים. שבר הדנ"א, שעשוי להיות גן, יכול להיות מבודד מדגם פרוקריוטי או אאוקריוטי. לאחר בידוד של שבר העניין, או להוסיף, הן הווקטור ואת ההוספה חייב להיות חתוך עם אנזימי הגבלה מטוהר. החלקים המטוהרים מחוברים יחד למרות טכניקה הנקראת קשירה. האנזים שמזרז את תגובת קשירה ידוע בשם ליגאז.

וידאו זה מסביר את השיטות העיקריות המשולבות, בד בבד, כדי לכלול את הליך השיבוט המולקולרי הכולל. היבטים קריטיים של שיבוט מולקולרי נדונים, כגון הצורך באסטרטגיית שיבוט מולקולרי וכיצד לעקוב אחר מושבות חיידקים שעברו טרנספורמציה. כמו כן מוזכרים שלבי אימות, כגון בדיקת plasmid מטוהר לנוכחות של הוספה עם מגבלות ורצף.

Procedure

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

שיבוט מולקולרי הוא קבוצה של טכניקות המשמשות להחדרת DNA רקומביננטי ממקור פרוקריוטי או אאוקריוטי לרכב משכפל כגון פלסמידים או וקטורים ויראליים. שיבוט מתייחס ליצירת עותקים רבים של שבר DNA של עניין, כגון גן. בסרטון זה תלמד על השלבים השונים של שיבוט מולקולרי, כיצד להגדיר את ההליך, ויישומים שונים של טכניקה זו.

לפחות שתי מולקולות דנ"א חשובות נדרשות לפני תחילת השיבוט. ראשית, והכי חשוב, אתה צריך את שבר ה- DNA שאתה הולך לשכפל, הידוע גם בשם להוסיף. זה יכול לבוא פרוקריוטה, אאוקריוטה, אורגניזם נכחד, או שזה יכול להיווצר באופן מלאכותי במעבדה. באמצעות שיבוט מולקולרי אנו יכולים ללמוד יותר על הפונקציה של גן מסוים.

שנית, אתה צריך וקטור. וקטור הוא DNA פלסמיד המשמש ככלי בביולוגיה מולקולרית כדי ליצור עותקים נוספים של חלבון או לייצר חלבון גן מסוים. פלסמידים הם דוגמה לווקטור, והם עגולים, כרומוזומליים נוספים, DNA המשוכפל על ידי חיידקים.

פלסמיד בדרך כלל יש אתר שיבוט מרובים או MCS, אזור זה מכיל אתרי זיהוי עבור אנדונקולאזים הגבלה שונים הידוע גם בשם אנזימי הגבלה. תוספות שונות ניתן לשלב לתוך plasmid על ידי טכניקה הנקראת קשירה. וקטור הפלסמיד מכיל גם מקור של שכפול, המאפשר לו להיות משוכפל בחיידקים. בנוסף, לפלסמיד יש גן אנטיביוטי. אם חיידקים משלבים את הפלסמיד, הוא ישרוד במדיה המכילה את האנטיביוטיקה. זה מאפשר את הבחירה של חיידקים שעברו שינוי בהצלחה.

ההוספה והווקטור משובטים לתוך אורגניזם של תאים מארחים, הנפוץ ביותר בשימוש בשיבוט מולקולרי הוא E. coli. E. coli גדל במהירות, זמין באופן נרחב ויש לו וקטורים שיבוט שונים רבים המיוצרים מסחרית. אוקריוטים, כמו, שמרים יכולים לשמש גם כאורגניזמים מארחים לווקטורים.

השלב הראשון של הליך השיבוט המולקולרי הכללי הוא להשיג את ההוספה הרצויה, אשר ניתן לגזור מ- DNA או mRNA מכל סוג תא. הווקטור האופטימלי והאורגניזם המארח שלו נבחרים לאחר מכן על בסיס סוג ההוספה ומה ייעשה בסופו של דבר עם זה. תגובת שרשרת פולימראז, או שיטה מבוססת PCR משמש לעתים קרובות כדי לשכפל את ההוספה.

לאחר מכן על ידי שימוש בסדרה של תגובות אנזימטיות, הכנס ועיכול מחוברים יחד ומוכנסים לאורגניזם המארח לשכפול המוני. וקטורים משוכפלים מטוהרים מחיידקים, ובעקבות עיכול מוגבל, מנותחים על ג'ל. שברים מטוהרים ג'ל נשלחים מאוחר יותר לרצף כדי לוודא כי הכניסה היא שבר ה- DNA הרצוי.

בואו נסתכל קצת יותר מפורט על אופן השיבוט המולקולרי. לפני שתתחיל, אתה רוצה לתכנן את אסטרטגיית השיבוט שלך, לפני ביצוע כל ניסיון שיבוט על הספסל. לדוגמה, כל וקטור plasmid נתון, יספק לך מספר סופי של אתרי הגבלה לשלב את ההוספה דרך אתר שיבוט מרובים. יהיה עליך לבחור אתרי הגבלה שלא נמצאו בהוספה שלך כדי שלא תדבק בה. אתה עלול להישאר עם מצב שבו אתה נאלץ להצטרף שבר קצה קהה עם אחד שיש לו overhang. אם כן, אז באמצעות קטע klenow כדי להגדיר קשירת קצה קהה עשוי להיות האפשרות היחידה שלך כדי לקבל את ההוספה לתוך הווקטור הרצוי שלך. הבנת כלי השיבוט המולקולריים השונים העומדים לרשותכם, כמו גם לבוא עם אסטרטגיה זהירה לפני שתתחיל שיבוט יכול להיות חיסכון זמן עצום.

מקור ה- DNA לשיבוט מולקולרי יכול להיות מבודד כמעט מכל סוג של דגימת תא או רקמה באמצעות טכניקות מיצוי פשוטות. לאחר בידוד, ניתן להשתמש ב- PCR כדי להגביר את ההוספה.

ברגע שהתוספת מוגברת הן היא והן הווקטור מתעכלים על ידי אנזימי הגבלה, הידועים גם בשם אנדונקולאזים מגבילים.

לאחר העיכול, ניתן להפעיל את ההוספה והווקטור על ג'ל ולטוהר על ידי תהליך הנקרא טיהור ג'ל. ביחס לווקטור, צעד זה יעזור לטהר פלסמיד ליניארי מפלסמיד לא מלוטש, אשר נוטה להופיע ככתם משקל מולקולרי גבוה על ג'ל.

לאחר ג'ל טיהור התקציר, התוסף הוא קשירה או מחובר plasmid, באמצעות אנזים הנקרא ligase DNA.

באופן כללי, זה תמיד רעיון טוב להגדיר קשירה, כך היחס של להוסיף לווקטור הוא 3 ל 1, אשר מבטיח כי רק כמות קטנה של וקטור יהיה ligate עצמית. לאחר שקשירת הקרח נקבעה על קרח, היא מדגירה בין 14-25 מעלות צלזיוס בין שעה ללילה.

לאחר מכן, טרנספורמציה מבוצעת כדי להציג את וקטור plasmid לתוך המארח כי ישכפל אותו.

חיידקי טרנספורמציה הבאים מצופים על צלחות אגר עם אנטיביוטיקה ודגרה לילה ב 37°C. מכיוון שהפלסטימיד מכיל גן עמיד לאנטיביוטיקה, טרנספורמציה מוצלחת תייצר מושבות חיידקיות כאשר יגדלו על לוחות אגר בנוכחות אנטיביוטיקה. לאחר מכן ניתן לקטוף מושבות בודדות מהצלחת שהשתנתה, להציב אותה למדיית צמיחה נוזלית בצינורות ממוספרים, ולהכניס אותה לאינקובטור רועד להתרחבות. נפח קטן של תרבות נוזלית מתווסף לצלחת אגר ממוספרת, בעוד שאר התרבות עוברת לטיהור פלסמיד. ערכת המספור המציינת את זהותן של מושבות חיידקים שמהן ינוצלו הפלסמידים בסופו של דבר נשמרת לאורך כל תהליך הטיהור של פלסמיד.

דגימה של פלסמיד מטוהר נחתכת לאחר מכן עם אנזימי הגבלה. לאחר מכן התקציר נטען ומופעל על הג'ל על מנת לבדוק את נוכחותו של הכנס, אשר יוודא כי מושבת החיידקים השתנתה עם plasmid המכיל תוספת ולא פלסמיד קשירה עצמית. חיידקים שאומתו כי השתנו עם plasmid המכילה, מורחבים לטיהור פלסמיד נוסף. רצף משמש כצעד אימות סופי כדי לאשר כי גן העניין שלך שוכפל.

שיבוט מולקולרי יכול לשמש עבור מספר כמעט בלתי מוגבל של יישומים. לדוגמה, כאשר תבנית mRNA מתומללת לאחור ליצירת cDNA, או DNA משלים, על-ידי אנזים הנקרא תעתיק הפוך ולאחר מכן PCR משמש להגברת ה- cDNA, ניתן להשתמש בשיבוט מולקולרי ליצירת ספריית cDNA – ספריה של כל הגנים המבוטאים על-ידי סוג תא נתון.

שיבוט מולקולרי יכול לשמש גם כדי לקחת סדרה של גנים, או אשכול גנים מזן חיידקי אחד, לארגן אותם מחדש לפלסמידים שהופכים בזן אחר, כך שניתן ליצור מסלול ביוסינתזה שלם כדי לייצר מולקולה מורכבת.

באמצעות שיבוט מולקולרי, ניתן ליצור ספריית מוטציות על ידי הבעת פלסמיד מטרה בזן חיידקי מיוחד המשתמש בפולימראז נוטה שגיאה כאשר הוא מתרבת בטמפרטורות מסוימות. המוטציות יכולות להיות מאופיינות ברצף. חיידקים שעברו טרנספורמציה עם גנים מוטנטיים יכולים להיבדק עם תרופות או כימיקלים שונים כדי לראות אילו מושבות חיידקים התפתחו כדי להיות עמידות לתרופות.

הודות לשיבוט מולקולרי, ניתן לשלב גנים עיתונאיים בפלסטיות DNA, גן עיתונאי נפוץ הוא חלבון פלואורסצנטי ירוק או GFP, הפולט פלואורסצנטיות ירוקה כאשר הם נחשפים לאור UV. גן כתב יכול גם להיות מוכנס לתוך וירוס אלפא כדי להראות זיהום יתושים ו transmissibility בתאים.

הרגע צפית בסרטון של ג'ובים על שיבוט מולקולרי. עכשיו אתה צריך להבין איך שיבוט מולקולרי עובד ואיך הטכניקה יכולה לשמש בביולוגיה מולקולרית. כמו תמיד, תודה שצפית!

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

לא הוכרזו ניגודי אינטרסים.

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter