Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Science Education
Biology I: yeast, Drosophila and C. elegans

A subscription to JoVE is required to view this content.
You will only be able to see the first 20 seconds.

 
Click here for the English version

효모 형질변환 및 클로닝

Overview

S. cerevisiae는 생물학 연구에서 일반적으로 사용되는 모델 유기체인 단세포 진핵생물입니다. 효모 연구원은 유전자 발현을 제어하고, 유전 적 삭제를 유도하고, 재조합 단백질을 표현하고, 세포 외 구조를 표시하기 위해 변형의 기본 기술 (세포에 의한 외국 DNA의 섭취)에 의존합니다.

이 비디오는 실험실에서 효모 변환이 수행되는 방법과 이유에 대한 개요를 제공합니다. 효모 플라스미드의 중요한 특징은 새로운 플라스미드를 통합하기 위해 효모 세포를 준비하는 데 필요한 절차와 함께 제시될 것입니다. 프리젠 테이션은 또한 효모 변환의 리튬 아세테이트 방법에 대한 단계별 프로토콜을 포함한다. 마지막으로 이 필수 기술의 많은 응용 분야의 예가 제공됩니다.

Procedure

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

효모 또는 사카로미세스 cerevisiae는,인간 적인 세포 프로세스에 통찰력을 줄 수 있는 유전학과 세포 생물학의 연구 결과에 사용된 광범위한 간단한 진핵모형 유기체입니다. 이 비디오는 효모 세포에 의한 외국 DNA의 섭취 - 변환에 대해 설명합니다. 효모 플라스미드, 변형을 위한 효모 세포를 준비하는 방법, 단계별 변환 절차를 소개하며, 이 근본적인 기술의 일부 응용을 제공할 것입니다.

효모의 변화에 대해 이야기하기 전에 먼저 변형에 사용되는 DNA 유형인 플라스미드에 대해 논의해 보겠습니다. 플라스미드는 세포막에서 모공을 쉽게 통과할 수 있도록 수퍼코일을 할 수 있는 작고 원형의 이중 가닥 DNA입니다.

플라스미드는 제한 엔도니션, 일명 "제한 효소"가 DNA를 절단 할 수있는 다중 복제 사이트 또는 MCS를 포함합니다. 같은 효소로 잘라 관심의 DNA 단편은 MCS로 회찰 될 수 있습니다. 플라스미드에는 복제가 시작되어야 하는 셀에 신호를 주는 복제 또는 ORI의 원점이 포함되어 있습니다. 또한, 플라스미드는 플라스미드를 함유하는 효모 세포가 특정 환경 조건하에서 자랄 수 있는 선택 가능한 마커를 갖는다. 플라스미드를 성공적으로 통합하지 않은 효모는 선택 가능한 마커를 포함하는 미디어에서 살아남지 못합니다. 선택 가능한 마커는 효모 균주가 그렇지 않으면 생성할 수 없는 아미노산을 합성할 수 있는 효소를 인코딩하는 약물 내성 또는 유전자를 가능하게 하는 유전자를 인코딩할 수 있습니다.

셔틀 벡터는 둘 이상의 호스트 종에서 복제 할 수있는 플라스미드입니다. 예를 들어, 대장균의 플라스미드는 효모에서 자랄 수 있습니다. 효모 플라스미드는 비 통합 또는 통합 될 수 있으며, 플라스미드가 게놈 DNA와 결합되거나 독립적으로 유지된다는 것을 의미합니다.

효모에 사용되는 플라스미드 또는 벡터의 다섯 가지 일반적인 유형이 있습니다. 효모의 변형에 가장 자주 사용되는 두 가지는 효모 상피 플라스미드 또는 YEp 및 효모 중심 막시 또는 YCp입니다. 이러한 유형의 벡터에는 자율 복제 시퀀스 또는 ARS가 포함됩니다. ARS는 복제의 기원을 포함하고 효모에서 초염색체 복제를 허용한다.

구엽 세포 방법, 전기 기화 및 리튬 아세테이트 매개 변환을 포함하는 효모를 변환하는 데 사용할 수있는 몇 가지 다른 절차가 있습니다. 이 비디오를 위해 우리는 리튬 아세테이트 절차에 초점을 맞출 것입니다.

이러한 변형 방법에서 양전하 리튬 양이온은 세포막 및 플라스미드 DNA 단일 좌초 DNA에 대한 전하를 중화하여 변형 혼합물에 첨가하여 효모의 세포벽에 결합하고 효모 세포에 의해 섭취할 수 있는 플라스미드 DNA를 떠난다. 온도의 급격한 증가에 노출, 또는 열 충격은 플라스미드 DNA가 통과할 수 있는 모공을 만드는 세포의 안쪽과 외부 사이 압력 차를 만듭니다. 온도가 감소하면 효모 세포벽이 개혁되고 변환이 완료됩니다.

효모를 변환하는 방법에 대한 단계별 절차부터 시작해 보겠습니다. 효모 세포는 먼저 천판에서 식민지를 따기와 효모 추출물 펩톤 덱스트로스 배지, 약식 YPD에서 식민지를 증폭시킴으로써 제조되어야 합니다 - 효모 성장을 위한 완전한 배지.

식민지를 접시에서 수확하여 YPD 매체에 배치한 후, 배양은 셰이커 또는 롤러 장치에 동요하여 30°C에서 하룻밤 사이에 배양됩니다. 효모 세포는 원심분리에 의해 펠릿화되고 과신은 제거됩니다. 펠렛 세포는 원하는 완충또는 멸균물로 재연된다. 이러한 유능한 준비 된 효모 세포는 변환 절차에 사용됩니다.

효모 세포가 준비되면 먼저 변환 혼합물을 준비하여 변환을 수행 할 수 있습니다.

이 시약 혼합물을 포함 해야 합니다.: 멸균 증류수; 50% 폴리에틸렌 글리콜 또는 PEG, 1M 리튬 아세테이트, 단일 좌초 DNA, 플라스미드 DNA 및 유능한 효모 세포의 10 mg/ml 용액의 용액. 효모 변환을 위한 실험실의 표준 프로토콜을 컨설팅하여 실험을 시작하기 전에 각 솔루션의 정확한 비율을 계산해야 합니다.

혼합물은 30°C에서 30°C로 배양되어 흔들림으로 30분간 배양됩니다. 효모 세포가 분해되지 않도록 용액은 소용돌이가 아닌 혼합되어야합니다.

세포는 42°C 수조에 15분 동안 배치하여 열 충격을 받은 다음 2분 동안 얼음을 냉각합니다. 세포는 원심분리에 의해 수확됩니다.

세포는 이중 증류수에서 재장매되고 원하는 변압제를 선택하는 천접시에 도금됩니다. 변환 플레이트는 식민지가 형성될 때까지 2 ~4 일 동안 30 °C에서 배양됩니다.

변환 절차에최적화될 때까지 항상 양수 및 음수 제어 플레이트가 포함되어야 합니다. 양극대조는 선택 가능한 마커를 포함하지 않는 YPD 플레이트에 플라스미드 DNA를 가진 효모 세포 현탁액이어야 한다. 이는 변환 절차에 따라 세포가 건강하다는 것을 보여줍니다. 음성 대조플레이트는 항생제를 포함하는 것과 같은 적절한 선택 플레이트에 효모 세포 현탁액이어야 한다. 접시에는 식민지가 없어야하며 오염이 없음을 보여줍니다.

효 모 변환에 대 한 다른 응용 프로그램의 무수 한 있다. 변형된 효모의 한 가지 적용은 효모 2 하이브리드 시스템을 사용하여 관심 있는 단백질 또는 미끼 단백질과 상호 작용하는 단백질을 식별하는 것입니다. 후보자 결합 파트너 또는 먹이 단백질의 라이브러리에서 플라스미드가 변형되고 상호 작용이있을 때, 베타 갈라콘토시다제와 같은 기자 유전자를 활성화시키는 전사 인자가 방출된다. 리포터 유전자는 X-gal을 포함하는 플레이트에 있을 때 상호 작용이 있는 식민지를 파란색으로 돌립니다 - 베타 갈라도시다아제에 대한 기판.

여러 삭제는 성적 사이클링을 사용하는 기술을 통해 효모로 설계 될 수 있습니다. 리포터와 삭제된 궤적을 포함하는 Haploid 세포는 임의의 구색 또는 메이오틱 재조합을 통해 한 세포로 결합됩니다. 선택 가능한 마커는 삭제를 성공적으로 통합한 효모를 선택하는 데 사용됩니다. 이 경우, 유동 세포측정은 GFP를 발현하는 세포를 선택하기 위해 사용된다.

효모는 단백질 단백질 상호 작용에 대한 돌연변이의 영향을 보기 위해 형광으로 표지된 단백질로 변형될 수 있습니다. 이 비디오 기사는 형광 현미경 검사를 사용하여 내시경증에 필수적인 단백질 단백질 상호 작용에 대한 다른 돌연변이의 효과를 연구했습니다.

효모 변환에 대한 JoVEs 비디오를 방금 시청했습니다. 이제 플라스미드의 기본 측면, 변형을 위해 효모 세포를 준비하는 방법 및 변환 절차를 수행하는 방법을 이해해야 합니다. 언제나처럼, 시청주셔서 감사합니다!

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

이해 상충이 선언되지 않았습니다.

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter