Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Science Education
Neuroscience

A subscription to JoVE is required to view this content.
You will only be able to see the first 20 seconds.

Cultura explanta do Tecido Neural
 
Click here for the English version

Cultura explanta do Tecido Neural

Overview

A estrutura complexa do sistema nervoso vertebrado surge de uma série complexa de eventos envolvendo diferenciação celular, migração celular e mudanças na morfologia celular. Estudar esses processos é essencial para nossa compreensão da função do sistema nervoso, bem como nossa capacidade de diagnosticar e tratar distúrbios que resultam do desenvolvimento anormal. No entanto, os tecidos neurais são relativamente inacessíveis para manipulações experimentais, especialmente em mamíferos embrionários. Como resultado, muitos cientistas aproveitam a cultura explant para estudar processos neurodesenvolvimentistas em um ambiente "organotípico", o que significa que o tecido é removido do organismo, mas sua complexa arquitetura celular é mantida. Geralmente, as culturas de explant são criadas por dissecção cuidadosa do tecido neural que é então submerso em mídia de crescimento cuidadosamente projetada e cultivada in vitro.

Este vídeo fornecerá primeiro uma breve visão geral da cultura de explant neural, incluindo suas vantagens sobre outros métodos in vitro e considerações importantes para a manutenção do tecido saudável. Em seguida, um protocolo geral será fornecido para a criação de uma cultura explant do cérebro de camundongos embrionários, delineando o isolamento de embriões da mãe e dissecção do cérebro. A apresentação também inclui uma visão geral da cultura de fatias, na qual finas seções de tecido do sistema nervoso são geradas para melhorar o acesso visual às células em desenvolvimento. Por fim, algumas aplicações dessas técnicas serão fornecidas para demonstrar como elas podem ser usadas para responder a perguntas importantes no campo do neurodesenvolvimento.

Procedure

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Culturas explantas servem como técnica para investigar o desenvolvimento de populações celulares específicas e estruturas neurais. Em experimentos de neurociência de desenvolvimento, explantas são tecidos neurais excisados de um embrião para desenvolvimento contínuo in vitro. Essas culturas dão aos pesquisadores a capacidade de manipular e visualizar os tecidos em desenvolvimento de maneiras que não são possíveis in vivo. Este vídeo introduzirá alguns princípios importantes por trás do trabalho com tecidos explantados, procedimentos passo a passo para duas abordagens para a cultura de explantar, bem como aplicações dessa técnica.

Antes de mergulhar nos métodos, vamos passar por cima de alguns princípios básicos. Explantas podem ser estabelecidas a partir de uma série de organismos modelo e uma variedade de tipos de tecidos. Geralmente, as culturas são criadas removendo cuidadosamente o tecido neural de um embrião, dissecando uma região de interesse e colocando-o em um ambiente artificial.

Tecidos também podem ser seccionados em folhas finas e cultivados em "cultura de fatias". Como o ambiente cultural é projetado para imitar as condições in vivo de todo o órgão, essa estratégia cultural é muitas vezes chamada de "organotípica".

Antes de começar, certifique-se de esterilizar seus instrumentos com 70% de etanol. Em seguida, eutanize um rato grávida usando o método preferido do seu laboratório. Em seguida, extirpar cirurgicamente o útero e colocar em tampão gelado. Transfira o prato para um microscópio de dissecção e remova embriões individuais de seu saco de gema. Em seguida, isole o cérebro, disseca cuidadosamente sua região de interesse, e transfira para um prato de cultura contendo meio de cultura. As explantas podem ser mantidas em uma incubadora de 37 °C contendo 5% de CO2 por algumas semanas, substituindo 50% do meio a cada 2 a 3 dias.

A cultura de fatias de tecido cerebral requer alguns passos extras. Antes da secção, o tecido é embutido em agarose, que fornece suporte ao tecido para que ele permaneça intacto enquanto está sendo cortado. Para isso, uma solução de ponto de fusão baixa de 1,5% é aquecida até que a agarose se dissolva. Em seguida, a agarose é transferida para a incorporação de moldes e permitida a esfriar ligeiramente para evitar danificar o tecido.

O tecido pode então ser cuidadosamente submerso e a agarose deixada para endurecer. Os blocos resultantes são aparados e colados a um estágio de espécime e seccionados usando um vibratome, que é um instrumento que usa uma lâmina vibrante para cortar finas fatias de tecido vivo. À medida que as fatias são geradas, elas são cuidadosamente transferidas para uma placa revestida contendo mídia cultural e cultivada como mencionado anteriormente.

Há uma série de vantagens em usar culturas explant sobre in vivo e outros métodos in vitro. Primeiro, as células em tecido explantado são mais acessíveis a ferramentas experimentais. Segundo, o fato de as explantas manterem a complexa arquitetura celular do desenvolvimento do tecido neural significa que as interações células-células podem ser estudadas. Em terceiro lugar, uma vez que eles podem controlar a composição química do meio de cultura, os cientistas podem usar explants para testar o efeito de compostos específicos no desenvolvimento de tecidos.

No entanto, uma vez que está sendo removido de seu ambiente natural, deve-se tomar cuidado especial para manter tecido feliz e saudável in vitro. Por exemplo, a presença de matriz extracelular, ou ECM, tem um impacto significativo no comportamento celular, de modo que proteínas ECM purificadas são frequentemente usadas para revestir pratos de cultura. Outra consideração importante é a solução na qual as explantas são banhadas. Embora a mídia tradicional da cultura celular seja frequentemente usada, alguns experimentos exigem soluções que se assemelham muito ao fluido que circula no sistema nervoso central: o fluido cefalorraquidiano, que é um reagente crítico em experimentos como os que você está prestes a ver.

Agora que passamos por cima de métodos de cultura explant, vamos ver como essas técnicas são usadas.

Ensaios de migração celular usam tecido explantado para examinar os sinais repulsivos e atraentes que estão envolvidos no movimento das células neurais. Neste experimento, contas que foram previamente encharcadas em fatores de crescimento são implantadas em explantas do cérebro traseiro para examinar a migração de células neurais. Após 3 a 4 dias de exposição, os neurônios foram imagens usando um microscópio confocal. Os resultados mostram que os neurônios motores migram para contas encharcadas em fator de crescimento endotelial vascular, mas não controlam contas encharcadas em tampão.

Ensaios de co-cultura são frequentemente usados para investigar interações célula-célula durante o desenvolvimento. Neste exemplo, segmentos da medula espinhal foram cultivados em cima de uma camada de células musculares para estudar como as conexões são feitas entre neurônios motores espinhais e músculo esquelético. Logo após 2 dias após a incubação, projeções dos neurônios, também conhecidos como neurites, são vistas emergindo da explanta. Dentro de 5 dias, a inervação funcional é observada pela contração da camada celular muscular.

Durante o desenvolvimento do sistema nervoso, os neurônios devem alongar seus axônios para estabelecer uma conexão entre o tecido alvo e o sistema nervoso central. Uma forma de estudar esse processo complexo é através de ensaios de orientação de axônio. Os pesquisadores usam tecidos explantados para examinar os fatores dentro dos neurônios e no ambiente circundante que ajudam a guiar o axônio para sua localização adequada.

Você acabou de ver o guia do JoVE para explantar a cultura do tecido neural. Este vídeo abordou uma visão geral das vantagens das culturas explant, estratégias culturais, protocolos passo a passo de dois procedimentos de explant comumente usados e como essas técnicas são usadas em laboratório hoje.

Obrigado por assistir!

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Nenhum conflito de interesses declarado.

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter