Immunology and Infection
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Rodent मलेरिया परजीवी अलैंगिक और यौन रक्त चरणों और मच्छर चरणों का फेनोटाइपिक विश्लेषण
Chapters
Summary May 30th, 2019
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मानव मलेरिया परजीवी के लिए जीवन चक्र और कृंतक मलेरिया परजीवी के जीव विज्ञान की हड़ताली समानताके कारण, कृंतक मलेरिया मॉडल मलेरिया अनुसंधान के लिए अपरिहार्य हो गए हैं। इसमें, हमने जंगली प्रकार और ट्रांसजेनिक कृंतक मलेरिया प्रजातियों के फीनोटाइपिक विश्लेषण में उपयोग की जाने वाली कुछ सबसे महत्वपूर्ण तकनीकों को मानकीकृत किया है।
Transcript
कृंतक मलेरिया परजीवी के जीवनचक्र और जीव विज्ञान की हड़ताली समानताओं के कारण, मानव मलेरिया परजीवी, कृंतक मलेरिया मॉडल मलेरिया अनुसंधान के लिए अपरिहार्य हो गए हैं। ये मानक विधियां मलेरिया अनुसंधान क्षेत्र में महत्वपूर्ण प्रश्नों के उत्तर देने में मदद कर सकती हैं कि जंगली प्रकार और ट्रांसजेनिक कृंतक मलेरिया प्रजातियों का फेनोटाइपिक विश्लेषण कैसे किया जाए। प्रक्रियाओं का प्रदर्शन स्नातक छात्रों Gozde Deveci और Ilknur Yilmaz मेरी प्रयोगशाला से होगा ।
क्रायो संरक्षित जमे हुए परजीवी स्टॉक को जल्दी से विगलन करके शुरू करें और तुरंत 26 गेज सुई से लैस एक मिलीलीटर सिरिंज का उपयोग करके लगभग 200 माइक्रोलीटर स्टॉक के साथ कम से कम दो दाता चूहों को जीनोटाइप इंट्रापेरिटोनली इंजेक्ट करें। इंजेक्शन के चौबीस घंटे बाद, पहले माउस की पूंछ को चुभने के लिए 24 या 26 गेज सुई का उपयोग करें और माइक्रोस्कोप स्लाइड पर रक्त की बूंद एकत्र करें। पहली स्लाइड में रक्त को जल्दी से धुंधला करने के लिए एक और स्लाइड के छोटे किनारे का उपयोग करें।
जब रक्त पूरी तरह से सूख गया हो, तो स्लाइड को कम से कम एक मिनट के लिए 100% मेथनॉल में ठीक करें। गिमसा में तय नमूनों को 10 से 15 मिनट के लिए दाग दें और इसके बाद सिंगल या डबल डिस्टिल्ड वॉटर वॉश करें । स्लाइड्स में जब सूख गए हैं, तो प्रति ग्रिड संक्रमित एरिथ्रोसाइट्स की कुल संख्या की गिनती के लिए हल्के माइक्रोस्कोप पर 100X उद्देश्य और तेल विसर्जन के तहत नमूनों को देखें ।
संक्रमण के दो से तीन दिन बाद, एक एनेस्थेटाइज्ड माउस को सुरक्षित करें जिसमें परजीवी रीढ़ की स्थिति में 0.1 से 1% के बीच पहुंच गया है और त्वचा चीरा के निर्माण को सुविधाजनक बनाने के लिए उरोस्थि के आधार के पास त्वचा को उठाने के लिए संदंश का उपयोग करें। डायाफ्राम और पेट की गुहा के शीर्ष को बेनकाब करने के लिए चीरा की साइट पर त्वचा को अलग खींचें और छाती गुहा में प्रवेश करने के लिए डायाफ्राम के माध्यम से काटने के दौरान रिबकेज के आधार को पकड़ने के लिए संदंश का उपयोग करें। दिल को बेनकाब करने के लिए रिबकेज को पिन करें और एक मिलीलीटर सिरिंज का उपयोग करें जिसमें हेपरिन के कम से कम 20 माइक्रोलीटर होते हैं और दिल के ऊतकों को धीरे-धीरे पंचर करने के लिए 26 गेज सुई से लैस होते हैं।
धीरे-धीरे लगभग एक मिलीलीटर रक्त एकत्र करने और रक्त को माइक्रोसेंट्रफ्यूज ट्यूब में वितरित करने के लिए प्लंजर को वापस लें। जब सभी रक्त काटा गया है, तो प्राप्तकर्ता चूहों को लाल गर्मी के दीपक के नीचे गर्म करें और परजीवी की उचित खुराक के साथ प्रति प्राप्तकर्ता 27 गेज सुई से लैस एक इंसुलिन सिरिंज लोड करें। फिर पहले प्राप्तकर्ता को एक निरोधक में रखें और संक्रमित एरिथ्रोसाइट्स की एक पूरी खुराक को एक फैली हुई पूंछ नस में इंजेक्ट करें।
मच्छरों को खिलाने के लिए, वयस्क चार से सात दिन की मादा एनोफेल्स स्टीफेंसी या ए. गैम्बेलिया मच्छरों को आठ से 12 घंटे तक भूखे रहने की अनुमति दें ताकि सबसे अधिक एक्स्लैगलेशन दर के साथ एनेस्थेटाइज्ड संक्रमित चूहों पर कम से 15 मिनट अधिक खिलाया जा सके । प्रति मच्छर ओसिस्ट स्पोरोजोइट्स की संख्या निर्धारित करने के लिए, फ्रीजर में 20 से 30 मच्छरों को कम से कम 10 मिनट के लिए न करें और उचित विच्छेदन समाधान वाले ग्लास स्लाइड पर मच्छरों के मिडगिट को विच्छेदन करने के लिए दूरबीन विच्छेदन गुंजाइश और दो 26 या 27 गेज सुइयों का उपयोग करें। मिडगुट को विच्छेदन करने के लिए, पहले पेट के निचले हिस्से को एक सुई के साथ रखें और पेट और छाती के बीच जंक्शन पर छाती को बहुत हल्के से ऊपर की दिशा में धकेल दें जब तक कि यह छाती को अलग नहीं करता और एक सफेद रंग का मिडगुट छाती से नीचे झूलने के संपर्क में न आए।
अब उसी सुई का उपयोग करके घेघा के अंत से मिडगुट को काट लें जिसका उपयोग छाती को ऊपर की ओर धकेलने के लिए किया जाता था, इस प्रकार मिडगुट को अलग और फैलाया जाता था। एक सुई का उपयोग कर विच्छेदन माध्यम से विच्छेदित मिडगुट उठाएं और इसे आरपीएमआई के 200 माइक्रोलीटर से भरी ट्यूब में स्थानांतरित करें। जब सभी मिडगट्स को विच्छेदित और काटा गया हो, तो मिडगट्स युक्त ट्यूब को 700 बार ग्राम पर एक मिनट के लिए सेंट्रलाइज में रखें।
फिर काटे गए ऊतकों को दो बार मूसल के साथ पीस लें। पतला ऊतक समाधान के 12 माइक्रोलीटर को हेमेसाइटोमीटर में स्थानांतरित करें और सामग्री को व्यवस्थित करने की अनुमति देने के लिए पांच मिनट के लिए कमरे के तापमान पर हेमेसाइटोमीटर को इनक्यूबेट करें। फिर चरण विपरीत और 40X आवर्धन के तहत हल्के माइक्रोस्कोप पर ओसिस्ट स्पोरोजोइट्स की औसत संख्या निर्धारित करें।
प्रति मच्छर लार ग्रंथि स्पोरोजोइट्स की संख्या निर्धारित करने के लिए, उचित समय बिंदु पोस्ट फीडिंग पर, 50 से 100 मादा मच्छरों को फ्रीज करें और लार ग्रंथियों को अलग करने के लिए एक विच्छेदन माइक्रोस्कोप और 26 या 27 गेज सुई के किनारे का उपयोग करें। लार ग्रंथियों को विच्छेदन करने के लिए, पहले एक सुई के बीच के पक्ष के साथ ऊपरी पेट या छाती को रखें और सिर को बहुत हल्के से धक्का दें और सिर और छाती के बीच जंक्शन पर बहुत कम धक्का दें। जब तक सिर को कांच की लार ग्रंथि को फाड़े बिना छाती से सावधानी से अलग न किया जाए तब तक पुश करें।
विच्छेदन माध्यम से विच्छेदित लार ग्रंथि को बढ़ाने के लिए एक छोटे ग्लास पाश्चर पिपेट का उपयोग करें और इसे 1.5 मिलीलीटर ट्यूब में रखें। जब सभी लार ग्रंथियों को विच्छेदित और काटा गया हो, तो ग्रंथियों वाली ट्यूब को 700 बार ग्राम पर एक मिनट के लिए अपकेंद्रित्र में रखें। काटे गए ऊतकों को दो बार मूसल के साथ पीस लें।
फिर लार ग्रंथि स्पोरोजोइट्स की औसत संख्या निर्धारित करें जैसा कि पहले किया गया था। ट्रांसजेनिक रिपोर्टर मलेरिया परजीवी एक मजबूत और संविलियन प्रमोटर के नियंत्रण में EGFP व्यक्त करने के लिए इंजीनियर रक्त चरणों में फ्लोरेसेंस संकेत, ookinetes, Anopheles stephensi मिडगट्स पर युवा oocysts, और sporozoites में Anopheles stephensi महिलाओं की लार ग्रंथियों से अलग प्रदर्शन । फ्लो साइटोमेट्री परजीवीता प्रतिशत मूल्य सीधे गिमसा दाग पतले रक्त स्मीयरों की निगरानी करके प्राप्त अनुमानित परजीवी प्रतिशत से मेल खाते हैं जैसा कि बाद की मात्राकरण विधि की वैधता की पुष्टि करता है।
इसके अलावा, प्रत्येक अलग-अलग अलैंगिक और यौन चरणों के प्रतिशत का आकलन एरिथ्रोसाइट्स के रूपात्मक मूल्यांकन पर निर्भर करता है जिसका मूल्यांकन प्रवाह साइटोमेट्री द्वारा नहीं किया जा सकता है। संक्रमण के इंट्रापेरिटोनियल बनाम नसों में मार्गों की तुलना संक्रमण के पहले चार दिनों के दौरान चतुर्थ संक्रमित समूह परजीवी प्रतिशत की तुलना में आईपी संक्रमित समूह परजीवी प्रतिशत में सांख्यिकीय रूप से महत्वपूर्ण कमी का पता चलता है कि संक्रमण का चतुर्थ मार्ग मलेरिया परजीवी रक्त चरणों के साथ परख के लिए अधिक मात्रात्मक रूप से सटीक मार्ग है। ध्यान दें, फिनाइलहाइड्राज़ीन उपचार गेमटोसाइट्स की संख्या में काफी वृद्धि करता है जो पुरुष गेमटे गठन की दर को बढ़ाता है जो बदले में निषेचन दर और बाद के सभी मच्छर चरणों की संख्या को बढ़ाता है।
कृंतक मलेरिया रक्त चरण परजीवी और मच्छर वेक्टर के लिए उनके संचरण के फेनोटाइपिकल विश्लेषण के लिए मानकीकृत तरीकों की कमी है। इन तरीकों से इन रोगजनकों और उनके जीवनचक्र चरणों का अध्ययन करने के लिए मानकीकृत और सरलीकृत प्रोटोकॉल प्रदान करने में मदद मिलेगी।
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