Neuroscience
This content is Open Access.
The JoVE video player is compatible with HTML5 and Adobe Flash. Older browsers that do not support HTML5 and the H.264 video codec will still use a Flash-based video player. We recommend downloading the newest version of Flash here, but we support all versions 10 and above.
If that doesn't help, please let us know.
Imaging neurale aktivitet i den primære somatosensoriske Cortex ved hjælp af Thy1-GCaMP6s Transgene mus
Chapters
Summary January 7th, 2019
Please note that all translations are automatically generated.
Click here for the English version.
Vi beskriver en eksperimentel metode til måling af neuronal aktivitet gennem dual optiske vinduer over bilaterale primære somatosensoriske corticies (S1) i Thy1-GCaMP6s Transgene mus bruger 2-foton (2 P) mikroskopi i vivo.
Transcript
Denne metode gør det muligt at registrere og kvantificere neurale aktivitet på tværs af musens bilaterale kortikale regioner i en længere periode in vivo. De to foton teknik har den fordel, at detektere aktivitet samtidigt i store eller spredte neuronal befolkning over en længere periode. Konsekvenserne af denne teknik udvidet mod undersøgelse af aktivitetsmønstre i definerede neuronale populationer i forskellige regioner af den levende hjerne.
12 timer før proceduren påbegyndes, varm de optiske vinduer ved 50 grader Celsius i 70% ethanol. Et optisk vindue består af et rundt fem millimeter diameter topdæksel glas og en bund del, der indeholder en rund tre-millimeter diameter dækglas. Ved afslutningen af opvarmning inkubationen, bekræfte en manglende reaktion på tå knivspids på en bedøvet 20 til 25-gram 1 1/2 til 2 1/2 måned gamle Thy1 GCaMP6s mus, og anvende salve til dyrets øjne.
Placer musen på en varmepude dækket med en steril drapere og bruge en hoved-bedrift adapter til mus til at stabilisere hovedet. Barber det meste af hovedbunden med en dobbelt-kant barbermaskine, og rense den eksponerede hud med sekventiel steril alkohol forberedelse puder og povidone-jod opløsning scrubs. Brug derefter en saks til at lave et rektangulært to gange tre millimeter skåret i hovedbunden på højre side af kraniet.
Ved hjælp af en vatpind, skubbe huden til side for at skabe en eksponering område på mere end tre millimeter i diameter, og bruge en stump mikrokirurgisk klinge til forsigtigt at fjerne bindevæv knyttet til kraniet. Med en tandboremaskine skal du forsigtigt markere en cirkel med en diameter på tre millimeter rundt om S1-området. Efter at have lavet en lignende cirkel på venstre side af kraniet, anvende et tyndt lag af cyanoacrylat superlim til begge sider af knoglen for at give en base for en dental cement ansøgning.
Under et dissekerende mikroskop skal du bruge en højhastighedsmikroborer til at tynde ned ad en cirkulær rille i højre side af kraniet omkring S1-området for at skabe en glat kant, der aspirerer knoglerester med et vakuum efter behov. Efter en ca. 2/3 knogledybde er opnået, langsomt og forsigtigt tynd de resterende 1/3 af knoglen, indtil en cirkulær knogle flap er blevet helt befriet fra det omgivende kranium. Brug et par 5/45 pincet til langsomt og forsigtigt at fjerne det cirkulære stykke knogle for at eksponere duraen, idet du skal passe på at undgå at beskadige pialbeholderne.
Efter fjernelse af en knogleklap fra venstre side af kraniet på samme måde, skyl det optiske vindue til højre side af kraniet med sterilt saltvand, og kontroller for mangler under et stereomikroskop. Installer det optiske vindue over kraniotomiregionen med den øverste del af vinduet hvilende på kraniet og den nederste del i kraniotomiseret åbning, hvilende på duraen, i overværelse af cerebral spinalvæske. Brug cyanoacrylat superlim til at forsegle den øverste del af det optiske vindue kant til kraniet.
Når limen er tørret, anvende sort dental cement til kanten af glasset, resten af højre side af det eksponerede kranium, og såret margener til at blokere lyset. Derefter installere den venstre optiske vindue og lad dyret til at inddrive med overvågning, indtil fuld recumbency. Syv til 10 dage efter indgrebet, placere bedøvet dyret i hoved-bedrift adapter på en varmepude under en to-foton mikroskop, idet det tager sig af, at det optiske vindue og højre side af kraniet er orienteret vinkelret på den optiske akse mikroskop.
Få et indledende referencekortbillede af kranievinduet ved hjælp af belysning i lysfeltet ved den fire gange store forstørrelse. Efter at have erhvervet flere billeder af samme region af interesse, billede calcium dynamik inden for S1 område i venstre halvkugle og beregne ændringerne i fluorescens fra hver region af interesse på begge sider af kraniet. I disse repræsentative billeder blev dendritter og et blodkar i en EGFP-udtrykkelig mus visualiseret på forskellige dybder i lag to i S1-regionen en dag efter installationen af det optiske vindue.
Z-projektionsbillederne blev taget på dag et og syv efter den optiske vinduesimplantation, hvilket illustrerer et bemærkelsesværdigt stabilt antal og placering af dendritiske grene og pigge i forsøgsperioden. Måling af den intracellulære calciumtransient hos Thy1 GCaMP6s transgene mus gør det muligt at kvantificere spontan calciumaktivitet og populationer af lag fem pyramideformede neuroner, der er placeret så dybt som mere end 500 mikrometer under pia, samt beregning af det gennemsnitlige antal spontane reaktioner over tid. En forsker, der er uddannet i både kraniel vindue forberedelse og in vivo to-foton calcium billeddannelse teknikker bør være i stand til at opnå optagelser af 100 til 200 neuroner på begge sider af kraniet i en til to dyr om dagen.
Med et åbent optisk vindue på hver side af kraniet, metoden gør det muligt at registrere den neurale aktivitet på tværs af symmetriske pattedyr hjerne regioner for langvarig og stabil calcium billeddannelse in vivo. Denne metode kan også bruges til at studere kortikal aktivitet og plasticitet efter ensidig skade på det perifere eller centralnervesystemet. Efter at have set denne video, bør du have en god forståelse af, hvordan du installerer bilaterale kranievinduer til måling af calcium dynamik ved hjælp af to-foton mikroskop i Thy1 GCaMP6s transgene mus.
Related Videos
You might already have access to this content!
Please enter your Institution or Company email below to check.
has access to
Please create a free JoVE account to get access
Login to access JoVE
Please login to your JoVE account to get access
We use/store this info to ensure you have proper access and that your account is secure. We may use this info to send you notifications about your account, your institutional access, and/or other related products. To learn more about our GDPR policies click here.
If you want more info regarding data storage, please contact gdpr@jove.com.
Please enter your email address so we may send you a link to reset your password.
We use/store this info to ensure you have proper access and that your account is secure. We may use this info to send you notifications about your account, your institutional access, and/or other related products. To learn more about our GDPR policies click here.
If you want more info regarding data storage, please contact gdpr@jove.com.
Your JoVE Unlimited Free Trial
Fill the form to request your free trial.
We use/store this info to ensure you have proper access and that your account is secure. We may use this info to send you notifications about your account, your institutional access, and/or other related products. To learn more about our GDPR policies click here.
If you want more info regarding data storage, please contact gdpr@jove.com.
Thank You!
A JoVE representative will be in touch with you shortly.
Thank You!
You have already requested a trial and a JoVE representative will be in touch with you shortly. If you need immediate assistance, please email us at subscriptions@jove.com.
Thank You!
Please enjoy a free 2-hour trial. In order to begin, please login.
Thank You!
You have unlocked a 2-hour free trial now. All JoVE videos and articles can be accessed for free.
To get started, a verification email has been sent to email@institution.com. Please follow the link in the email to activate your free trial account. If you do not see the message in your inbox, please check your "Spam" folder.
