Neuroscience
This content is Open Access.
The JoVE video player is compatible with HTML5 and Adobe Flash. Older browsers that do not support HTML5 and the H.264 video codec will still use a Flash-based video player. We recommend downloading the newest version of Flash here, but we support all versions 10 and above.
If that doesn't help, please let us know.
Imaging Neural aktivitet i den primära somatosensoriska Cortex med Thy1-GCaMP6s transgena möss
Chapters
Summary January 7th, 2019
Please note that all translations are automatically generated.
Click here for the English version.
Vi beskriver en experimentell förfarande för mätning av neuronal aktivitet genom dubbla optiska fönster ovanför bilaterala primära somatosensoriska corticies (S1) i Thy1-GCaMP6s transgena möss med hjälp av 2-foton (2 P) mikroskopi i vivo.
Transcript
Denna metod möjliggör registrering och kvantifiering av neural aktivitet över mus bilaterala när regioner under en längre tid in vivo. De två foton teknik har fördelen av att upptäcka aktivitet samtidigt i stora eller spridda neuronal befolkningen under en längre period. Konsekvenserna av denna teknik utvidgas mot undersökningen av verksamhet mönster i definierade neuronala populationer i olika regioner i den levande hjärnan.
12 timmar innan du börjar proceduren, värma de optiska fönstren vid 50 grader Celsius i 70%etanol. Ett optiskt fönster består av en rund fem-millimeters diameter topp täcka glas och en botten del som innehåller en rund tre-millimeters diameter täckglas. I slutet av uppvärmningen inkubation, bekräfta en brist på svar på tå nypa på en sövd 20 till 25-gram 1 1/2 till 2 1/2 månad gammal Thy1 GCaMP6s mus, och tillämpa salva på djurets ögon.
Placera musen på en värmedyna täckt med en steril drapera och använd en huvudhållande adapter för möss för att stabilisera huvudet. Raka de flesta av hårbotten med en dubbel-kant rakkniv, och rengör den exponerade huden med sekventiell steril alkohol förberedelse kuddar och povidone-jod lösning scrubs. Använd sedan en sax för att göra en rektangulär två med tre millimeter skära i hårbotten på höger sida av skallen.
Med hjälp av en bomullspinne, tryck huden åt sidan för att skapa ett exponeringsområde på större än tre millimeter i diameter, och använd en trubbig mikrokirurgisk blad för att försiktigt ta bort bindväven fäst vid skallen. Med en tandborr, försiktigt markera en tre millimeter diameter cirkel runt S1 området. Efter att ha gjort en liknande cirkel på vänster sida av skallen, applicera ett tunt lager av cyanoakrylat superlim på båda sidor av benet för att ge en bas för en tandcement ansökan.
Under ett dissekerande mikroskop, använd en höghastighetsmikrosborr för att tunna ner ett cirkulärt spår i den högra sidan av skallen runt S1-området för att skapa en slät kant, som aspirerar benresterna med ett vakuum vid behov. Efter att ett ungefär 2/3 bendjup har uppnåtts, långsamt och försiktigt tunna resterande 1/3 av ben tills en cirkulär benklaff har helt befriats från den omgivande skallen. Använd ett par 5/45-pinps för att långsamt och försiktigt ta bort den cirkulära benbiten för att exponera dura, var försiktig för att undvika att skada pialkärlen.
Efter att ha tagit bort en benklaff från den vänstra sidan av skallen på samma sätt, skölj det optiska fönstret för den högra sidan av skallen med steril koksaltlösning, och kontrollera om det finns brister i ett stereomikroskop. Installera det optiska fönstret över regionen craniotomy med den övre delen av fönstret vilar på skallen och den nedre delen inom craniotomized öppning, vilar på dura, i närvaro av cerebral spinal vätska. Använd cyanoakrylat superlim för att täta den övre delen av den optiska fönsterkanten till skallen.
När limmet har torkat, applicera svart tandcement till kanten av glaset, resten av den högra sidan av den exponerade skallen, och såret marginaler för att blockera ljuset. Installera sedan det vänstra optiska fönstret och låt djuret återhämta sig med övervakning tills full recumbency. Sju till 10 dagar efter ingreppet, placera det sövda djuret i huvud-anläggning adapter på en värmedyna under en två-foton mikroskop, var noga med att det optiska fönstret och den högra sidan av skallen är orienterade vinkelrätt mot den optiska axeln av mikroskopet.
Förvärva en första referens kartbild av kranialfönstret med hjälp av bright-field belysning vid fyra gånger förstoring. Efter att ha förvärvat flera bilder av samma intresseområde, bild kalcium dynamiken inom S1 området i den vänstra halvklotet och beräkna förändringarna i fluorescens från varje region av intresse på båda sidor av skallen. I dessa representativa bilder, dendrites och ett blodkärl inom en EGFP-uttrycker musen var visualiseras på olika djup i lager två av S1 regionen en dag efter installationen av det optiska fönstret.
Z-projektion bilderna togs vid dagar ett och sju efter den optiska fönstret implantation, illustrerar en anmärkningsvärt stabil antal och placering av dendritiska grenar och taggar under den experimentella perioden. Mätning av den intracellulära kalciumtransienten i Thy1 GCaMP6s transgena möss möjliggör kvantifiering av spontan kalciumaktivitet och populationer av skikt fem pyramidala nervceller som ligger så djupt som större än 500 mikrometer under pia samt beräkning av det genomsnittliga antalet spontana svar över tiden. En forskare utbildad i både kranial fönster beredning och in vivo två-foton kalcium avbildningsteknik bör kunna få inspelningar av 100 till 200 nervceller på båda sidor av skallen i ett till två djur per dag.
Med ett öppet optiskt fönster på varje sida av skallen möjliggör metoden registrering av den neurala aktiviteten över symmetriska däggdjurshjärnregioner för långvarig och stabil kalciumavbildning in vivo. Denna metod kan också användas för att studera kortikal aktivitet och plasticitet efter ensidig skada på det perifera eller det centrala nervsystemet. Efter att ha sett den här videon, bör du ha en god förståelse för hur man installerar bilaterala kranialfönster för mätning av kalciumdynamik med hjälp av två-fotonmikroskop i Thy1 GCaMP6s transgena möss.
Related Videos
You might already have access to this content!
Please enter your Institution or Company email below to check.
has access to
Please create a free JoVE account to get access
Login to access JoVE
Please login to your JoVE account to get access
We use/store this info to ensure you have proper access and that your account is secure. We may use this info to send you notifications about your account, your institutional access, and/or other related products. To learn more about our GDPR policies click here.
If you want more info regarding data storage, please contact gdpr@jove.com.
Please enter your email address so we may send you a link to reset your password.
We use/store this info to ensure you have proper access and that your account is secure. We may use this info to send you notifications about your account, your institutional access, and/or other related products. To learn more about our GDPR policies click here.
If you want more info regarding data storage, please contact gdpr@jove.com.
Your JoVE Unlimited Free Trial
Fill the form to request your free trial.
We use/store this info to ensure you have proper access and that your account is secure. We may use this info to send you notifications about your account, your institutional access, and/or other related products. To learn more about our GDPR policies click here.
If you want more info regarding data storage, please contact gdpr@jove.com.
Thank You!
A JoVE representative will be in touch with you shortly.
Thank You!
You have already requested a trial and a JoVE representative will be in touch with you shortly. If you need immediate assistance, please email us at subscriptions@jove.com.
Thank You!
Please enjoy a free 2-hour trial. In order to begin, please login.
Thank You!
You have unlocked a 2-hour free trial now. All JoVE videos and articles can be accessed for free.
To get started, a verification email has been sent to email@institution.com. Please follow the link in the email to activate your free trial account. If you do not see the message in your inbox, please check your "Spam" folder.
