Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Science Education
Cell Biology

A subscription to JoVE is required to view this content.
You will only be able to see the first 20 seconds.

אסיית ההגירה של טרנסוול
 
Click here for the English version

אסיית ההגירה של טרנסוול

Overview

העברת תאים בתגובה לרמזים כימיים חיונית להתפתחות, חסינות ומדינות מחלות כגון סרטן. כדי לכמת את נדידת התאים, ב-1961 פותחה ב-1961 נדידת תאים פשוטה על ידי ד"ר סטיבן בוידן, הידוע כיום כ"נדידת טרנסוול" או "ביי קאמרית של בוידן". ערכה זו מורכבת מהכנסת המפרידה בין בארות של צלחת רב-וול לתאים העליונים והתחתוניים. תאים שיש לחקור את נדידתם נזרעים בתא העליון והפתרון הכימותרפי ממוקם בתא התחתון. לאחר הדגירה, ספירת התאים בתא התחתון מאפשרת כימות של הגירה הנגרמת על ידי כימותרפיה.

סרטון וידאו זה יסקור את ההגדרה הניסיונית הנפוצה למחקרי העברת תאים. לאחר מכן נבליט כמה שיקולים מרכזיים, ויתאר פרוטוקול כללי להפעלת ניסוי הכולל תאים חסידים. לבסוף, נסקור התאמות שונות של הגדרת זה המשמשת כיום לחקר גורמים שונים המשפיעים על ההגירה.

Procedure

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

נדידת טרנסוול היא טכניקה קלאסית המאפשרת למדענים לכמת את תנועת התאים. העברה מתייחסת ליכולתו של תא לנוע בנפרד או באשכולות. תנועות תאים מתאפשרות באמצעות ארגון מחדש מדויק של הציטוסקלטון שלהם והנדידה מתרחשת בדרך כלל בתגובה לגירויים הפועלים כרמזים.

היום, נדון בבחינת ההגירה הטרנסוולית, שמשתמשת במערך תא פשוט כדי להעריך הגירה בתגובה לרמזים מושכים.

נתחיל על ידי מתן קצת מידע רקע על תא transwell.

המנגנון תוכנן לראשונה על ידי ד"ר סטיבן בוידן בשנת 1961, שהשתמש בו כדי לחקור את הגירת הלויקוציטים. לכן, שיטה זו ידועה גם בשם אסאי חדר בוידן.

בתא בויידן פשוט, הקיר החיצוני הוא של בארות, כמו אלה של צלחת 96-באר. בתוך כל באר, טרנסוול, שהוא תוספת גלילית, ממוקם. לתוספת יש קרום פוליקרבונט בגודל נקבובית מוגדר. כאשר הוא ממוקם בבאר, הוא מחלק את התא לשני תאים. התא העליון הוא המקום שבו תאים שהתנהגות הנדידה שלהם היא להיחקר יהיה זרע, ואת המאגר התחתון הוא המקום שבו הפתרון של chemoattractant ממוקם. בהגדרה, כימותרפיה היא מולקולה שיש לה את היכולת לקדם תנועתיות תאים על ידי "משיכת תאים".

בשל כוחות אטרקטיביים אלה, תאים בתא העליון נודדים דרך הנקבוביות אל המאגר התחתון. אם לתאים יש תכונות דבקות, כמו כמה תאי מלנומה, בעקבות התנועה הם "מקל" לחלק התחתון של הממברנה. במקרה זה, ניתן לתקן את הממברנה, להכתים אותה, וניתן לספור תאים מתחת למיקרוסקופ. מצד שני, תאים שאינם דבקים, כמו זרע, יעברו למאגר התחתון. במקרה זה, תאים בפתרון המאגר ניתן לספור בעזרת המוציטומטר.

למרות ההתקנה עבור מבחן זה הוא פשוט, ישנם כמה דברים שאתה צריך לשקול לפני הניסוי. בואו נעבור על כמה מהם.

החל מפתרון הזריעה, עליך לוודא שהצפיפות ממוטבת כדי לצפות בנדידת תאים. מעט מדי תאים יכולים לגרום לנדידה בלתי ניתנת לגילוי, וצפיפות גדולה יותר תאכלס יתר על המידה את הממברנה, מה שמקשה על הספירה של ההגירה. השיקול השני הוא גודל הנקבבובית של ההוספה. יש לבחור אותו בקפידה בהתאם לסוג התא. אם גודל הנקבבובית קטן מדי, התאים לא יוכלו לעבור דרכם.

לחלופין, אם גודל הנקבבובית גדול מדי, תאים פשוט ייפלו, וזה לא העברה. לבסוף, יש לשים לב לריכוז הכימותרפי וזמן הדגירה שיש לאפשר הגירה, שכן אלה תלויים זה בזה. ריכוז אופטימלי עם זמן דגירה מתאים שבמהלכו ריכוז הדרגתי נשמר בין התאים, גורמת לנדידת תאים בשל המשיכה הכימותרפית. לעומת זאת, דגירה ממושכת עשויה להיות מלווה בשיווי משקל של כימותרפיה בכל התא המוביל לאובדן שיפוע כימי, אשר יכול לבלבל את ניתוח התוצאות שהושגו.

בהתחשב בשיקולים אלה, בואו נדון בפרוטוקול המשמש למדידת הגירה של תאים חסידים.

תאים שיש לתחקר מוכנים במדיום נטול פרוטאז, שכן פרוטאזים יכולים להוקיע קולטני ממברנה חשובים, ובסופו של דבר להשפיע על ההגירה. לאחר תאים מוכנים, ההשעיה צריכה להיות מדוללת לצפיפות זריעה אופטימלית. על מנת להכין את התא, transwells ממוקמים בארות על צלחת multiwell. מתלה תא צריך להיות pipetted לתוך transwell מבלי לגעת בממברנה או החדרת בועות אוויר.

פתרון Chemoattractant הוא pipetted לתוך המאגר התחתון, מוודא הפתרון נוגע בקרום של הכנס. זמן הדגירה של הנדידה יהיה תלוי בשיקולים הניסיוניים. לאחר הדגירה, הממברנות קבועות על ידי טבילת ההוספה לתוך 70% אתנול. לאחר מתן אפשרות לתוספת להתייבש, נוסף תמיסת כתמי תאים.

לאחר מכן, תאים הם דגירה במשך כ 30 דקות בטמפרטורת החדר. לאחר הדגירה, התוספות נשטפות בעזרת חוצץ כביסה. לבסוף, ניתן לחתוך את הממברנה ולהניח אותה על שקופית מיקרוסקופ. תאים בחלק התחתון של הממברנה מייצגים את מספר התאים שהיגרו בנוכחות ובהיעדר כימותרפיה.

מאז, עכשיו יש לך תחושה של הפרוטוקול, בואו נסתכל בקצרה על איך חוקרים משתמשים בשיטה זו בחקירות שלהם.

אחד היישומים הנפוצים ביותר של זה assay הוא להעריך תכונות chemoattractant של תרכובות לא ידועות. כאן, מדענים התעניינו בבחינת נתיבי שחייה של זרע צפרדע בנוכחות אלורין, שהוא חומר המופרש על ידי ביצי דו-חיים. כדי לעשות זאת, הם העבירו תחילה זרע צפרדע פעיל לחלק העליון של התוספות הטרנסווליות. לתחתית, הם הוסיפו אלורין. לאחר שאפשרו לתאים לנדוד, הם ספרו זרע בתמיסת המאגר תחת מיקרוסקופ. באמצעות טכניקה זו, הם הצליחו ליצור עקומת תגובת ריכוז המתארת את ההשפעה של ריכוז אלורין על נדידת זרע.

כאשר תא מותקף על ידי פתוגנים, הוא שולח כימותרפיה לגייס תאים חיסוניים הנודדים, לצרף, ולאחר מכן לפתור זיהום. כדי לבחון את התופעה, מדענים אלה תרבדו תאי אפיתל בצד התחתון של התוספות. לאחר מכן, הם הדביקו תאים אלה בזנים שונים של חיידקים. לבסוף, הם הכניסו תאי חיסון לתא העליון. ידוע כי התאים הנגועים מייצרים מספר כימותרפיה הגורמת לנדידת תאי החיסון. תוצאות ניסוי זה הדגימו דרגות שונות של נדידת נויטרופילים בתגובה לסוגים שונים של זיהום חיידקי.

לבסוף, פלישת תאים סרטניים וחלטה דרך המטריצה החוץ תאית תמיד סיקרנו ביולוגים של תאים. כאן, מדענים רצו לקבוע כיצד כימותרפיה ספציפית יכולה לתרום לנדידה כזו באמצעות מטריצה תלת-ממדית. הם מהונדסים גנטית שתי בריכות נפרדות של תאים: אחת המבטאת פלואורסצנטית ירוקה, והאחר פלואורסצנטי אדום, חלבון. לאחר מכן הם העבירו מטריצה-חיקוי חוץ-תאית לראש הטרנסוולים.

לאחר שהתגבשו, הם הקימו את הטרנסוול וזרעו שתי בריכות תאים לחלק התחתון של הממברנה. לאחר מכן, הם החליפו את ההחדרה לתוך צלחת multiwell והכניסו את הפתרון הכימותרפי לתא העליון. זה גרם לתאים בתחתית לנוע למעלה ודרך מטריצת 3D. בעזרת הדמיה קונפוקלית, חוקרים אלה שיחזרו את העברת התאים בתלת-ממד, והבחינו בין דפוסי ההעברה של שתי קבוצות תאים.

הרגע צפית בסרטון של ג'וב על מבדת ההגירה של טרנסוול. עם ההבנה של הרכיבים והפרוטוקול של שיטה זו, עכשיו אתה יודע למה זה נמצא בשימוש נרחב כל כך על ידי ביולוגים תא. למרות הפשטות של התקנה זו, מגוון התצורות שיטה זו יכולה להתאים עושה את זה הכרחי עבור מחקרי תנועתיות התא. כמו תמיד, תודה שצפית!

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

לא הוכרזו ניגודי אינטרסים.

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter