Saggi enzimatici e cinetica
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Overview
La cinetica enzimatica descrive gli effetti catalitici degli enzimi, che sono biomolecole che facilitano le reazioni chimiche necessarie per gli organismi viventi. Gli enzimi agiscono sulle molecole, denominate substrati, per formare prodotti. I parametri cinetici enzimatici sono determinati tramite saggi che misurano direttamente o indirettamente i cambiamenti nella concentrazione del substrato o del prodotto nel tempo.
Questo video coprirà i principi di base della cinetica enzimatica (comprese le equazioni di velocità) e i modelli cinetici. Vengono inoltre discussi i concetti che regolano i saggi enzimatici, seguiti da un tipico saggio colorimetrico. La sezione applicazioni discute un saggio enzimatico tramite analisi FRET (Förster resonance energy transfer), caratterizzando l’attività enzimatica extracellulare nell’ambiente e studiando la cinetica di riparazione del DNA utilizzando sonde molecolari.
Gli enzimi sono catalizzatori biochimici essenziali per la vita. I saggi enzimatici sono utilizzati per studiare le proprietà cinetiche delle reazioni enzimatiche, delucidando gli effetti catalitici degli enzimi. Questo video coprirà la cinetica enzimatica e i saggi, esaminerà una procedura generale e mostrerà alcuneapplicazioni.
Gli enzimi sono proteine, o meno spesso RNA, che agiscono su un reagente specifico, indicato come substrato. Un enzima riduce l’energia di attivazione necessaria per avviare una reazione biochimica, facendo sì che la reazione si verifichi a un ritmo più veloce.
Le reazioni enzimatiche possono essere suddivise in tre componenti elementari. Il primo è la formazione del complesso enzima-substrato, formato dal legame del substrato al sito attivo dell’enzima. Il complesso può decomposire nei suoi costituenti originali. Questa è la seconda reazione elementare. In alternativa, il complesso può formare il prodotto e recuperare l’enzima, la terza reazione elementare.
La cinetica di una reazione elementare è data dall’equazione della legge elementare del tasso. Le equazioni della legge del tasso danno il tasso in termini di concentrazione dei reagenti e una costante di velocità. Ciascuna delle reazioni elementari ha un’equazione di legge di velocità individuale, con la propria costante di velocità. Queste equazioni possono essere distillate in un modello cinetico noto come equazione di Michaelis-Menten. Questo dà la velocità di reazione in termini di concentrazione del substrato; che può essere determinato sperimentalmente. Alcune tendenze generali per le reazioni enzimatiche possono essere identificate usando l’equazione di Michaelis-Menten. Ad alta concentrazione di substrato, viene raggiunto un punto di saturazione, chiamato Vmax. Qui, la velocità è limitata dalla concentrazione totale dell’enzima e dal numero di molecole di substrato che un enzima converte in prodotto per un dato tempo, noto anche come kcat. Nella cinetica di Michaelis-Menten kcat è una delle due costanti che governano la velocità di reazione. L’altra costante, KM, è nota come costante di affinità. KM è anche equivalente alla concentrazione dove la velocità di reazione è equivalente a mezzo Vmax . Un enzima con un’affinità più alta avrà un KM inferiore e raggiungerà Vmax più velocemente, mentre un enzima con affinità inferiore avrà un KM più alto e impiegherà più tempo a raggiungere Vmax. Conoscere kcat e KM consente di confrontare gli enzimi. Per fare questo usiamo un rapporto chiamato efficienza enzimatica. Un kcat più alto e km più basso si traducono in efficienze più elevate, mentre ungatto k più basso e km più alto si traduce in un numero inferiore.
I fattori utilizzati per chiarire la cinetica enzimatica devono essere determinati sperimentalmente. Questi saggi vengono in genere eseguiti mescolando un enzima e una soluzione di substrato in un ambiente controllato. Le osservazioni vengono effettuate misurando le variazioni di concentrazione del substrato, del prodotto o dei sottoprodotti rispetto al tempo.
La variazione della concentrazione nel tempo viene utilizzata per determinare la velocità di reazione. Per determinare la cinetica, i dati sulla velocità devono essere ottenuti a concentrazioni multiple. Se un grafico della velocità iniziale inversa rispetto alla concentrazione iniziale inversa, nota come trama di Lineweaver-Burk, è lineare, allora la reazione segue la cinetica di Michaelis-Menten. La pendenza e l’intercetta della linea consentono la determinazione dei parametri cinetici KM e Vmax,che possono quindi essere utilizzati per calcolare kcat e l’efficienza enzimatica.
Ora che i principi della cinetica enzimatica sono stati discussi, diamo un’occhiata a come viene eseguito un tipico saggio enzimatico.
In questa procedura viene dimostrato un test colorimetrico. Il primo passo è generare una curva standard, che correlerà l’assorbanza con la concentrazione del substrato. Le soluzioni di concentrazione nota vengono preparate insieme a un campione di controllo. Viene aggiunta una soluzione di sviluppo che reagisce con il substrato per produrre un composto colorato. L’assorbanza viene misurata e tracciata rispetto alla concentrazione per generare la curva standard.
Per eseguire il test, viene preparata una concentrazione nota di substrato insieme alla quantità appropriata di enzima. L’enzima e il substrato vengono miscelati e lasciati incubare per un intervallo di tempo prestabilito. Il pH e la temperatura sono controllati con soluzioni tampone e blocchi riscaldanti. Viene aggiunto un agente di tempra per fermare la reazione. La soluzione dello sviluppatore viene quindi aggiunta alle reazioni e mescolata. Le soluzioni vengono quindi poste in cuvette e viene misurata l’assorbanza. La quantità di substrato consumato viene determinata confrontando l’assorbanza misurata con la curva standard. Utilizzando i dati raccolti, le velocità di reazione iniziali sono determinate tracciando la concentrazione nel tempo. Infine, con i dati di tasso e concentrazione, viene realizzato il grafico di Michaelis-Menten. Ciò consente la determinazione delle proprietà cinetiche per l’enzima come il numero di turnover e l’efficienza enzimatica.
Ora che abbiamo esaminato una procedura di analisi, diamo un’occhiata ad altri modi in cui vengono eseguiti i test e alle loro applicazioni.
In questa procedura l’analisi FRET viene utilizzata per studiare la cinetica di una proteasi idrolizzando un legame peptidico di una proteina. Queste emissioni possono essere misurate, consentendo un’analisi continua e quantitativa del consumo e della produzione del substrato, aiutando nella determinazione della cinetica di reazione.
I saggi enzimatici possono essere utilizzati nelle scienze ambientali per determinare i livelli di attività enzimatica extracellulare nell’ambiente. Acque, suoli e sedimenti possono essere raccolti dall’ambiente e lavorati in laboratorio. L’attività enzimatica extracellulare di questi materiali può quindi essere caratterizzata utilizzando saggi enzimatici. Questo è uno strumento utile per capire come l’ambiente elabora il materiale organico.
Il meccanismo di riparazione del DNA di una cellula può essere valutato studiando la cinetica degli enzimi presenti nel nucleo. La velocità con cui un enzima rimuove le lesioni del DNA, o danni, può essere misurata utilizzando beacon molecolari fluorescenti, che fluoresce solo quando legati a sequenze di DNA uniche. Il livello di riparazione del DNA può essere misurato in tempo reale rilevando i prodotti di scissione etichettati in modo fluorescente.
Hai appena visto il video di JoVE sulla cinetica enzimatica e sui saggi. Questo video ha spiegato la cinetica enzimatica, ha coperto i concetti di analisi, ha esaminato una procedura generale e ha descritto alcune applicazioni.
Grazie per l’attenzione!
Procedure
Disclosures
Transcript
Enzymes are biochemical catalysts that are essential for life. Enzyme assays are used to study the kinetic properties of enzymatic reactions, elucidating the catalytic effects of enzymes. This video will cover enzyme kinetics and assays, go over a general procedure, and show some applications.
Enzymes are proteins, or less often RNAs, that act on a specific reactant, referred to as the substrate. An enzyme reduces the activation energy needed to initiate a biochemical reaction, causing the reaction to occur at a faster rate.
Enzymatic reactions can be broken up into three elementary components. The first is the formation of the enzyme-substrate complex, formed by the binding of the substrate to the enzyme active site. The complex can decompose into its original constituents. This is the second elementary reaction. Alternatively, the complex can form the product and recover the enzyme, the third elementary reaction.
The kinetics of an elementary reaction is given by the elementary rate law equation. Rate law equations give the rate in terms of the concentration of the reactants and a rate constant. Each of the elementary reactions has an individual rate law equation, with its own rate constant. These equations can be distilled down to a kinetic model known as the Michaelis-Menten equation. This gives the reaction rate in terms of the substrate concentration; which can be experimentally determined. Some general trends for enzyme reactions can be identified using the Michaelis-Menten equation. At high substrate concentration, a saturation point is reached, called Vmax. Here, the rate is limited by the total enzyme concentration, and the number of substrate molecules an enzyme converts into product per given time, also known as kcat. In Michaelis-Menten kinetics kcat is one of the two constants that govern reaction rate. The other constant, KM, is known as the affinity constant. KM is also equivalent to the concentration where the reaction rate is equivalent to one-half Vmax . An enzyme with a higher affinity will have a lower KM and reach Vmax faster, while an enzyme with lower affinity will have a higher KM and take longer to reach Vmax. Knowing kcat and KM allows for enzymes to be compared. To do this we use a ratio called enzyme efficiency. Higher kcat and lower KM result in higher efficiencies, while lower kcat and higher KM results in lower.
The factors used to elucidate enzyme kinetics must be determined experimentally. These assays are typically performed by mixing an enzyme and substrate solution in a controlled environment. Observations are made by measuring the changes in concentration of the substrate, product, or byproducts with respect to time.
The change in concentration over time is used to determine the reaction rate. In order to determine the kinetics, rate data must be obtained at multiple concentrations. If a plot of the inverse initial rate vs. inverse initial concentration, known as the Lineweaver-Burk plot, is linear, then the reaction follows Michaelis-Menten kinetics. The slope and intercept of the line allow for the determination of the kinetic parameters KM and Vmax, which can then be used to calculate kcat and the enzyme efficiency.
Now that the principles of enzyme kinetics have been discussed, let’s look at how a typical enzyme assay is performed.
In this procedure a colorimetric assay is demonstrated. The first step is to generate a standard curve, which will correlate absorbance with substrate concentration. Solutions of known concentration are prepared along with a control sample. A developer solution that reacts with the substrate is added to produce a colored compound. Absorbance is measured and plotted against concentration to generate the standard curve.
To perform the assay, a known concentration of substrate is prepared along with the appropriate amount of enzyme. The enzyme and substrate are mixed and allowed to incubate for a set time interval. pH and temperature are controlled with buffer solutions and heating blocks. A quenching agent is added to stop the reaction. Developer solution is then added to the reactions and mixed. The solutions are then placed in cuvettes and absorbance is measured. The amount of substrate consumed is determined by comparing the measured absorbance to the standard curve. Using the collected data, initial reaction rates are determined by plotting concentration over time. Finally, with the rate data and concentration, the Michaelis-Menten plot is made. This allows for the determination of kinetic properties for the enzyme such as turnover number and enzyme efficiency.
Now that we’ve reviewed an assay procedure, let’s look at other ways assays are performed and their applications.
In this procedure FRET analysis is used to study the kinetics of a protease hydrolyzing a peptide bond of a protein. These emissions can be measured, allowing for a continuous and quantitative analysis of substrate consumption and production, aiding in the determination of the reaction kinetics.
Enzyme assays can be used in environmental science to determine the levels of extracellular enzyme activity in the environment. Waters, soils, and sediments can be collected from the environment and processed in the laboratory. Extracellular enzymatic activity of these materials can then be characterized using enzyme assays. This is a useful tool for understanding how the environment processes organic material.
A cell’s DNA repair mechanism can be evaluated by studying the kinetics of enzymes found in the nucleus. The rate at which an enzyme removes DNA lesions, or damages, can be measured using fluorescent molecular beacons, which only fluoresce when bound to unique DNA sequences. The level of DNA repair can be measured in real time by detecting the fluorescently labeled cleavage products.
You’ve just watched JoVE’s video on enzyme kinetics and assays. This video explained enzyme kinetics, covered assay concepts, went over a general procedure, and described some applications.
Thanks for watching!
