Förster Resonance Energietransfer (FRET)
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Overview
Förster Resonanz Energietransfer (FRET) ist ein Phänomen Nahbereich biochemische Wechselwirkungen untersucht. In Bund kann ein Spender Photoluminescent Molekül nicht Strahlungs-Energie zu einem Akzeptor Molekül übertragen, wenn ihre jeweiligen Emission und Absorption Spektren überschneiden. Die Menge an Energie zu übertragen — und folglich die gesamte Emission von Probe — richtet sich nach der Nähe des Pair Akzeptor-Spender Photoluminescent Moleküle. Bund-Analyse wird kombiniert mit anderen Techniken der Biochemie Detailinformationen von biomolekularer Strukturen und Wechselwirkungen daraus zu bekommen “ spektroskopische Lineal. ”
dieses Video behandelt die Prinzipien und Konzepte des Bund-Analyse. Das Verfahren konzentriert sich auf die Probenvorbereitung für Bund und Möglichkeiten zu präsentieren und Interpretation von Daten. Zu guter Letzt zu den Anwendungen gehören Überwachung Konformationsänderungen und zelluläre Prozesse durch Kennzeichnung von Teilen einer Zelle oder Protein, Überwachung Enzymreaktionen, die Protein-Strukturen zu verändern und mit Bund, um Aggregation von Monomeren, die zum Ausdruck gebrachten Zellen zu überwachen.
Förster Resonance Energy Transfer oder Bund, ist eine nichtstrahlenden Übertragung von Energie zwischen Licht emittierende Moleküle und wird oft verwendet, um Nahbereich biochemische Wechselwirkungen zu untersuchen. Bund nur auftritt, wenn die fluoreszierende Moleküle verteilt sind, innerhalb von 10 nm voneinander entfernt. Bund-Analyse kombinierbar mit anderen Techniken, um strukturelle Detailinformationen zu erhalten. Dieses Video wird einführen die zugrunde liegenden Prinzipien der Bund, eine Protokoll und Daten Präsentation zusammenfassen und diskutieren einige biochemische Anwendungen.
A Photoluminescent Molekül wie ein Fluorophor freut sich durch Absorption von elektromagnetischer Strahlung bei einer Wellenlänge in sein Absorptionsspektrum. Sobald es sich entspannt, strahlt sie Licht bei einer Wellenlänge innerhalb seiner Emissionsspektrum. Für weitere Informationen über Fluoreszenz, siehe Jupiter ' s-video auf Fluoreszenz-Mikroskopie. Verschiedenen Fluorophore absorbieren und emittieren Licht in verschiedenen Wellenlängen, die häufig überschneiden. Wenn das Emissionsspektrum einer Fluorophor deutlich mit Absorptionsspektrum von einem anderen Fluorophor, überlappt der “ Spender ” erscheint ein virtuelles Photon, der von aufgenommen wird die “ Akzeptor ”. Wenn ein aufgeregter Spender ist innerhalb von 10 nm ein Akzeptor, Energie wird vom Spender auf Akzeptor von Dipol-Dipol Interaktionen übertragen. Die Freisetzung von Energie durch Emission von Licht aus dem Spender sinkt entsprechend. Unterdessen strahlt der aufgeregte Akzeptor Licht auf seine Emissionswellenlänge. Die Bund-Reaktion ist im Hinblick auf Effizienz, oder der Anteil der Energie, die vom Spender durch Bund und nicht durch Fluoreszenz oder andere Strahlungs Prozesse bewertet. Der Wirkungsgrad hängt stark von der Entfernung zwischen dem Spender und Akzeptor, wodurch Bund als Handeln ein ' molekulare ' oder ' spektroskopische ' Lineal.
In der Biochemie, Bund dient oft qualitativ beobachten Konformationsänderungen in Molekülen durch die Überwachung Fluorophore, wie sie in und aus Bund Reichweite zueinander bewegen. In ähnlicher Weise können Zellfunktionen mit Molekülen, die mit einem Bund paar studiert werden. Wenn die beschriftete Molekül durch Enzym-Aktivität, Bund stoppt und die beobachteten Fluoreszenz Wellenlänge Änderungen gespalten ist.
Nun, da Sie die Prinzipien hinter Bund zu verstehen, lassen Sie ' s Blick auf ein Protokoll und ein paar Möglichkeiten zu präsentieren und zu interpretieren die Daten im Überblick.
vor dem Experiment, die Biomoleküle von Interesse, in der Regel DNA oder Proteine, sind konstruiert mit fluoreszierenden Tags mit molekularbiologischen Techniken. gemeinsame Wege, die modifizierte einzuführen genetisches Material in die Zellen gehören Transfektion und Elektroporation.
Dann, die Zellen sind zum Beispiel für Bund Visualisierung auf einem Fluoreszenz-Mikroskop. vorbereitet, die Moleküle können auf einer Folie für die Einzelmolekül-Bund immobilisiert werden oder Proben werden in Vertiefungen für Hochdurchsatz-Screening geladen.
Sind dann die Erregung Laser, Mikroskop und zugehörigen Ausrüstungen bereit. (A) Bund Experimente beinhalten oft starke Lasern; (B) also geeignete PSA und Sicherheitsverfahren verwendet werden sollte. die Probe dann in das Gerät gelegt und mit der Erregung Laser beleuchtet.
für Experimente, die Überwachung des Verhaltens der Zelle, Farbe zeigen Unterschiede Bilder oder Veränderungen der Emissionsintensität verwendet werden. Donor und Akzeptor Emissionsintensitäten geplottet zusammen um Bund Antwort im Laufe der Zeit zu verfolgen.
Bund Daten können auch verschiedene Funktionen für komplexere Analysen montiert werden. Je nach dem Experiment Daten dargestellt in mehrfacher Hinsicht zu besten dar die Ergebnisse machen ein flexible experimentelles Werkzeug ärgern.
nun, dass Sie ' vertraut mit den Grundlagen des Laufens und eine Bund-Experiment zu analysieren, lassen Sie ' s Blick auf einige Anwendungen der Bund in der Biochemie Forschung.
Bund kann verwendet werden, um Konformationsänderungen oder zelluläre Prozesse zu studieren, durch Kennzeichnung der Teile des Proteins oder Zelle voraussichtlich innerhalb 10 nm voneinander entfernt mit einem Bund-paar. Beispielsweise werden Protein-Sensoren durch Kennzeichnung Rezeptoren mit ein paar Fluorophore vorbereitet. Die Bund-Reaktion wird live von konfokalen Mikroskopie überwacht. Variation der Emissionswellenlänge und Intensität zeigen Konformationsänderungen.
Bund kann auch verwendet werden, durch die Moleküle mit einem aktiven Bund paar Vorbereitung und Beobachtung der Veränderungen in der Antwort. Wenn das Substrat gespalten ist, wird Bund gestört, was zu einer Erhöhung im Spender-Emission und eine Abnahme der Akzeptor Emission. Die Emissionen werden analysiert, um festzustellen, Beiträge von Donor und Akzeptor Bund. Sobald die direkte Emissionsfaktoren für die Cyan und gelb fluoreszierende Proteine berechnet werden, die Konzentration und kinetische Parameter des Substrates ermittelt werden.
Zellen entwickelt, um Monomere mit entweder einer Bund-paar-Funktion als express ' Sensoren ' für Interaktionen zwischen den Monomeren. Wenn Aggregation von diese Monomere induziert wird, ist eine Bund Reaktion beobachtet. Dies kann verwendet werden, zu untersuchen, Proteinaggregation, ausgelöst durch ' Aussaat ' fehlgefaltete Proteine. Hier wurden Zellen mit Aggregaten des Proteins des Interesses, inkubiert und mit Durchflusszytometrie analysiert ausgestrahlt.
Sie ' Ve beobachtete, wie Jupiter ' s-video auf Förster Resonance Energy Transfer oder FRET. Dieses Video enthält die grundlegenden Prinzipien des Bund, Vorbereitung und Analyse von einer Bund-Experiment und ein paar biochemische Anwendungen.
Vielen Dank für das Ansehen von!
Procedure
Disclosures
Transcript
Förster Resonance Energy Transfer, or FRET, is a non-radiative transfer of energy between light-emitting molecules, and is often used to investigate close-range biochemical interactions. FRET only occurs when fluorescent molecules are spaced within 10 nm of each other. FRET analysis can be combined with other techniques to obtain detailed structural information. This video will introduce the underlying principles of FRET, summarize a protocol and data presentation, and discuss some biochemical applications.
A photoluminescent molecule such as a fluorophore is excited by absorbing electromagnetic radiation at a wavelength in its absorption spectrum. As it relaxes, it emits light at a wavelength within its emission spectrum. For more information about fluorescence, see JoVE’s video on fluorescence microscopy. Different fluorophores absorb and emit light at different wavelengths, which frequently overlap. If the emission spectrum of a fluorophore overlaps significantly with the absorption spectrum of another fluorophore, the “donor” will release a virtual photon, which is absorbed by the “acceptor”. When an excited donor is within 10 nm of an acceptor, energy is transferred from donor to acceptor by dipole-dipole interactions. The release of energy by emission of light from the donor correspondingly decreases. Meanwhile, the excited acceptor emits light at its emission wavelength. The FRET response is evaluated in terms of efficiency, or the percentage of energy released from the donor by FRET rather than by fluorescence or other radiative processes. The efficiency depends strongly on the distance between the donor and acceptor, which allows FRET to act as a ‘molecular’ or ‘spectroscopic’ ruler.
In biochemistry, FRET is often used qualitatively to observe conformational changes in molecules by monitoring fluorophores as they move in and out of FRET range of each other. Similarly, cellular functions can be studied with molecules containing a FRET pair. If the labeled molecule is cleaved by enzyme activity, FRET stops and the observed fluorescence wavelength changes.
Now that you understand the principles behind FRET, let’s look at an overview of a protocol and a few ways to present and interpret the data.
Prior to the experiment, the biomolecules of interest, typically DNA or proteins, are engineered with fluorescent tags, using molecular biology techniques. Common ways to introduce the modified genetic material into the cells include transfection and electroporation.
Then, the cells are prepared for FRET visualization on a fluorescence microscope. For instance, the molecules may be immobilized on a slide for single-molecule FRET, or samples are loaded into wells for high-throughput screening.
Then, the excitation lasers, microscope, and associated equipment are prepared. (A) FRET experiments often involve powerful lasers; (B) so appropriate PPE and safety procedures should be used. The sample is then placed in the instrument and illuminated with the excitation laser.
For experiments monitoring cell behavior, color images showing differences or changes in emission intensity are used. Donor and acceptor emission intensities are plotted together to track FRET response over time.
FRET data can also be fitted to various functions for more complex analyses. Depending on the experiment, data may be presented in multiple ways to best represent the results, making FRET a flexible experimental tool.
Now that you’re familiar with the basics of running and analyzing a FRET experiment, let’s look at some applications of FRET in biochemistry research.
FRET can be used to study conformational changes or cellular processes by labeling parts of the protein or cell predicted to move within 10 nm of each other with a FRET pair. For example, protein sensors are prepared by labeling receptors with a pair of fluorophores. The FRET response is monitored live by confocal microscopy. Variation of emission wavelength and intensity indicate conformational changes.
FRET can also be used by preparing molecules with an active FRET pair and observing changes in the response. When the substrate is cleaved, FRET is disrupted, causing an increase in donor emission and a decrease in acceptor emission. The emissions are analyzed to determine contributions by donor, acceptor, and FRET. Once the direct emission factors are calculated for the cyan and yellow fluorescent proteins, the concentration and kinetic parameters of the substrate can be determined.
Cells designed to express monomers containing either of a FRET pair function as ‘sensors’ for interactions between those monomers. If aggregation of those monomers is induced, a FRET response is observed. This can be used to investigate protein aggregation triggered by ‘seeding’ of misfolded proteins. Here, cells were transduced with aggregates of the protein of interest, incubated, and analyzed with flow cytometry.
You’ve just watched JoVE’s video on Förster Resonance Energy Transfer, or FRET. This video contained the underlying principles of FRET, preparation and analysis of a FRET experiment, and a few biochemical applications.
Thanks for watching!
