Förster Resonance Energy Transfer, o FRET, è un trasferimento non radiativo di energia tra molecole che emettono luce ed è spesso usato per studiare le interazioni biochimiche a distanza ravvicinata. FRET si verifica solo quando le molecole fluorescenti sono distanziate entro 10 nm l’una dall’altra. L’analisi FRET può essere combinata con altre tecniche per ottenere informazioni strutturali dettagliate. Questo video introdurrà i principi alla base di FRET, riassumerà un protocollo e la presentazione dei dati e discuterà alcune applicazioni biochimiche.

Una molecola fotoluminescente come un fluoroforo è eccitata assorbendo la radiazione elettromagnetica a una lunghezza d’onda nel suo spettro di assorbimento. Mentre si rilassa, emette luce a una lunghezza d’onda all’interno del suo spettro di emissione. Per ulteriori informazioni sulla fluorescenza, vedere il video di JoVE sulla microscopia a fluorescenza. Diversi fluorofori assorbono ed emettono luce a diverse lunghezze d’onda, che spesso si sovrappongono. Se lo spettro di emissione di un fluoroforo si sovrappone in modo significativo allo spettro di assorbimento di un altro fluoroforo, il “donatore” rilascerà un fotone virtuale, che viene assorbito dall'”accettore”. Quando un donatore eccitato si trova entro 10 nm da un accettore, l’energia viene trasferita da donatore ad accettore mediante interazioni dipolo-dipolo. Il rilascio di energia per emissione di luce dal donatore diminuisce di conseguenza. Nel frattempo, l’accettore eccitato emette luce alla sua lunghezza d’onda di emissione. La risposta FRET viene valutata in termini di efficienza, ovvero la percentuale di energia rilasciata dal donatore da FRET piuttosto che dalla fluorescenza o da altri processi radiativi. L’efficienza dipende fortemente dalla distanza tra il donatore e l’accettore, che consente a FRET di agire come un righello “molecolare” o “spettroscopico”.

In biochimica, FRET è spesso usato qualitativamente per osservare i cambiamenti conformazionali nelle molecole monitorando i fluorofori mentre si muovono dentro e fuori dalla gamma FRET l’uno dell’altro. Allo stesso modo, le funzioni cellulari possono essere studiate con molecole contenenti una coppia FRET. Se la molecola etichettata viene scissa dall’attività enzimatica, FRET si ferma e la lunghezza d’onda di fluorescenza osservata cambia.

Ora che hai compreso i principi alla base di FRET, diamo un’occhiata a una panoramica di un protocollo e ad alcuni modi per presentare e interpretare i dati.

Prima dell’esperimento, le biomolecole di interesse, tipicamente DNA o proteine, sono ingegnerizzate con tag fluorescenti, utilizzando tecniche di biologia molecolare. I modi comuni per introdurre il materiale genetico modificato nelle cellule includono la trasfezione e l’elettroporazione.

Quindi, le cellule vengono preparate per la visualizzazione FRET su un microscopio a fluorescenza. Ad esempio, le molecole possono essere immobilizzate su un vetrino per FRET a singola molecola, oppure i campioni vengono caricati in pozzetto per lo screening ad alto rendimento.

Quindi, vengono preparati i laser di eccitazione, il microscopio e le apparecchiature associate. (A) Gli esperimenti FRET spesso coinvolgono potenti laser; B) devono essere utilizzati DPI e procedure di sicurezza adeguati. Il campione viene quindi inserito nello strumento e illuminato con il laser di eccitazione.

Per gli esperimenti di monitoraggio del comportamento cellulare, vengono utilizzate immagini a colori che mostrano differenze o cambiamenti nell’intensità delle emissioni. Le intensità di emissione del donatore e dell’accettore sono tracciate insieme per tracciare la risposta FRET nel tempo.

I dati FRET possono anche essere adattati a varie funzioni per analisi più complesse. A seconda dell’esperimento, i dati possono essere presentati in diversi modi per rappresentare al meglio i risultati, rendendo FRET uno strumento sperimentale flessibile.

Ora che hai familiarità con le basi dell’esecuzione e dell’analisi di un esperimento FRET, diamo un’occhiata ad alcune applicazioni di FRET nella ricerca biochimica.

FRET può essere utilizzato per studiare i cambiamenti conformazionali o i processi cellulari etichettando parti della proteina o della cellula che si prevede si muovano entro 10 nm l’una dall’altra con una coppia FRET. Ad esempio, i sensori proteici vengono preparati etichettando i recettori con una coppia di fluorofori. La risposta FRET viene monitorata dal vivo mediante microscopia confocale. La variazione della lunghezza d’onda e dell’intensità di emissione indica cambiamenti conformazionali.

FRET può anche essere utilizzato preparando molecole con una coppia FRET attiva e osservando i cambiamenti nella risposta. Quando il substrato viene scisso, FRET viene interrotto, causando un aumento delle emissioni dei donatori e una diminuzione delle emissioni degli accettori. Le emissioni vengono analizzate per determinare i contributi da donatore, accettore e FRET. Una volta calcolati i fattori di emissione diretta per le proteine fluorescenti ciano e gialle, è possibile determinare la concentrazione e i parametri cinetici del substrato.

Le celle progettate per esprimere monomeri contenenti una delle due coppie FRET funzionano come “sensori” per le interazioni tra questi monomeri. Se viene indotta l’aggregazione di questi monomeri, si osserva una risposta FRET. Questo può essere usato per studiare l’aggregazione proteica innescata dalla “semina” di proteine mal ripiegate. Qui, le cellule sono state trasdotte con aggregati della proteina di interesse, incubate e analizzate con citometria a flusso.

Hai appena visto il video di JoVE su Förster Resonance Energy Transfer, o FRET. Questo video conteneva i principi di base di FRET, la preparazione e l’analisi di un esperimento FRET e alcune applicazioni biochimiche.

Grazie per l’attenzione!