JoVE Science Education
Biochemistry
A subscription to JoVE is required to view this content.  Sign in or start your free trial.
JoVE Science Education Biochemistry
Förster Resonance Energy Transfer (FRET)
  • 00:00Overview
  • 00:46Principles of FRET
  • 02:53Performing the FRET Experiment
  • 03:50Data Presentation and Analysis
  • 04:29Applications
  • 06:15Summary

Förster התהודה העברת אנרגיה (FRET)

English

Share

Overview

העברת אנרגיית תהודה Förster (FRET) היא תופעה המשמשת לחקר אינטראקציות ביוכימיות לטווח קרוב. ב- FRET, מולקולת פוטולומינסנט תורם יכולה להעביר אנרגיה באופן לא רדיקטיבי למולקולת קבלה אם ספקטרום הפליטה והספיגה שלהם חופפים. כמות האנרגיה המועברת – וכתוצאה מכך הפליטה הכוללת של המדגם – תלויה בקרבת זוג מולקולות פוטו-לומינסנט של מקבל-תורם. ניתוח FRET משולב עם טכניקות ביוכימיה אחרות כדי לקבל מידע מפורט של מבנים ביומולקולריים ואינטראקציות מ”סרגל ספקטרוסקופי “זה.

וידאו זה מכסה את העקרונות והמושגים של ניתוח FRET. ההליך מתמקד בהכנת דוגמאות עבור FRET ודרכים להציג ולפרש נתונים. לבסוף, היישומים כוללים ניטור תהליכים קונפורמיים ותאיים על ידי תיוג חלקים של תא או חלבון, ניטור תגובות אנזימים שמשנות מבני חלבון, ושימוש ב- FRET לניטור צבירה של מונומרים המובעים על ידי תאים.

Förster תהודה העברת אנרגיה, או FRET, הוא העברה לא מקרינה של אנרגיה בין מולקולות פולטת אור, והוא משמש לעתים קרובות כדי לחקור אינטראקציות ביוכימיות לטווח קרוב. FRET מתרחשת רק כאשר מולקולות פלואורסצנטיות מרווחות בתוך 10 ננומטר זו מזו. ניתוח FRET ניתן לשלב עם טכניקות אחרות כדי לקבל מידע מבני מפורט. וידאו זה יציג את העקרונות הבסיסיים של FRET, יסכם פרוטוקול ומצגת נתונים, וידון בכמה יישומים ביוכימיים.

מולקולה פוטולומינסנטית כמו פלואורופור מתרגשת מספיגת קרינה אלקטרומגנטית אורך גל בספקטרום הקליטה שלה. כשהוא נרגע, הוא פולט אור אורך גל בתוך ספקטרום הפליטה שלו. למידע נוסף על פלואורסצנטיות, ראו סרטון של JoVE על מיקרוסקופיית פלואורסצנטיות. פלואורופורים שונים סופגים ולפוטים אור באורכי גל שונים, אשר חופפים לעתים קרובות. אם ספקטרום הפליטה של פלואורופור חופף באופן משמעותי עם ספקטרום הספיגה של פלואורופור אחר, “התורם” ישחרר פוטון וירטואלי, אשר נספג על ידי “מקבל”. כאשר תורם נרגש נמצא בטווח של 10 ננומטר של מקבל, אנרגיה מועברת מתורם לקבל על ידי אינטראקציות דיפול-דיפול. שחרור האנרגיה על ידי פליטת אור מהתורם בהתאמה פוחתת. בינתיים, המקבל הנרגש פולט אור אורך גל הפליטה שלו. תגובת FRET מוערכת במונחים של יעילות, או אחוז האנרגיה ששוחררה מהתורם על ידי FRET ולא על ידי פלואורסצנטיות או תהליכים רדיאטוריים אחרים. היעילות תלויה מאוד במרחק בין התורם לבין המקבל, המאפשר FRET לפעול כשליט ‘מולקולרי’ או ‘ספקטרוסקופי’.

בביוכימיה, FRET משמש לעתים קרובות באופן איכותי כדי לבחון שינויים קונפורמציה במולקולות על ידי ניטור פלואורופורים כשהם נעים פנימה והחוצה של טווח FRET אחד של השני. באופן דומה, ניתן ללמוד פונקציות תאיות עם מולקולות המכילות זוג FRET. אם המולקולה המסומנת מכווצת בפעילות אנזימים, FRET מפסיק ואורך הגל הנצפה של פלואורסצנטיות משתנה.

כעת, כאשר אתם מבינים את העקרונות שמאחורי FRET, בואו נסתכל על סקירה כללית של פרוטוקול וכמה דרכים להציג ולפרש את הנתונים.

לפני הניסוי, הביומולקולות של עניין, בדרך כלל DNA או חלבונים, מהונדסים עם תגי פלורסנט, באמצעות טכניקות ביולוגיה מולקולרית. דרכים נפוצות להכניס את החומר הגנטי שונה לתוך התאים כוללים transfection ואלקטרופורציה.

לאחר מכן, התאים מוכנים להדמיה FRET על מיקרוסקופ פלואורסצנטי. לדוגמה, המולקולות עשויות להיות משותקות בשקופית עבור FRET של מולקולה אחת, או שדגימות נטענות לבארות להקרנת תפוקה גבוהה.

לאחר מכן, לייזרי העירור, המיקרוסקופ והציוד הנלווה מוכנים. (א) ניסויי FRET כרוכים לעתים קרובות לייזרים חזקים; (ב) יש להשתמש ב- PPE ובהליכי בטיחות מתאימים. לאחר מכן המדגם ממוקם בכלי ומואר בלייזר העירור.

לניסויים המנטרים את התנהגות התאים, נעשה שימוש בתמונות צבע המציגות הבדלים או שינויים בעוצמת הפליטה. עוצמות פליטת התורמים והמקבלים זוממות יחד כדי לעקוב אחר תגובת FRET לאורך זמן.

ניתן גם להתאים נתוני FRET לפונקציות שונות עבור ניתוחים מורכבים יותר. בהתאם לניסוי, הנתונים עשויים להיות מוצגים בדרכים מרובות כדי לייצג בצורה הטובה ביותר את התוצאות, מה שהופך את FRET לכלי ניסיוני גמיש.

עכשיו שאתם מכירים את היסודות של ריצה וניתוח ניסוי FRET, בואו נסתכל על כמה יישומים של FRET במחקר ביוכימיה.

FRET יכול לשמש כדי ללמוד שינויים קונפורמציה או תהליכים תאיים על ידי תיוג חלקים של החלבון או התא צפוי לנוע בתוך 10 ננומטר אחד של השני עם זוג FRET. לדוגמה, חיישני חלבון מוכנים על ידי תיוג קולטנים עם זוג פלואורופורים. תגובת FRET מנוטרת בשידור חי על ידי מיקרוסקופיה קונפוקלית. וריאציה של אורך גל פליטה ועוצמת מצביעה על שינויים קונפורמציה.

FRET יכול לשמש גם על ידי הכנת מולקולות עם זוג FRET פעיל התבוננות בשינויים בתגובה. כאשר המצע מבקע, FRET מופרע, מה שגורם לעלייה בפליטת התורמים ולירידה בפליטת מקבל. הפליטות מנותחות כדי לקבוע תרומות על ידי תורם, מקבל ו FRET. לאחר גורמי הפליטה הישירים מחושבים עבור חלבונים פלואורסצנטיים ציאן וצהוב, ניתן לקבוע את הריכוז ואת הפרמטרים הקינטיים של המצע.

תאים שנועדו לבטא מונומרים המכילים אחד מצמד FRET מתפקדים כ’חיישנים ‘ לאינטראקציות בין אותם מונומרים. אם צבירה של מונומרים אלה מושרה, תגובת FRET הוא ציין. זה יכול לשמש כדי לחקור צבירה חלבון מופעלת על ידי ‘זריעה’ של חלבונים misfolded. כאן, תאים הועברו עם אגרגטים של חלבון של עניין, דגירה, וניתח עם ציטומטריית זרימה.

הרגע צפית בסרטון של ג’וב על העברת אנרגיה תהודה של פורסטר, או FRET. וידאו זה הכיל את העקרונות הבסיסיים של FRET, הכנה וניתוח של ניסוי FRET, וכמה יישומים ביוכימיים.

תודה שצפיתם!

Procedure

העברת אנרגיית תהודה Förster (FRET) היא תופעה המשמשת לחקר אינטראקציות ביוכימיות לטווח קרוב. ב- FRET, מולקולת פוטולומינסנט תורם יכולה להעביר אנרגיה באופן לא רדיקטיבי למולקולת קבלה אם ספקטרום הפליטה והספיגה שלהם חופפים. כמות האנרגיה המועברת – וכתוצאה מכך הפליטה הכוללת של המדגם – תלויה בקרבת זוג מולקולות פוטו…

Disclosures

No conflicts of interest declared.

Transcript

Förster Resonance Energy Transfer, or FRET, is a non-radiative transfer of energy between light-emitting molecules, and is often used to investigate close-range biochemical interactions. FRET only occurs when fluorescent molecules are spaced within 10 nm of each other. FRET analysis can be combined with other techniques to obtain detailed structural information. This video will introduce the underlying principles of FRET, summarize a protocol and data presentation, and discuss some biochemical applications.

A photoluminescent molecule such as a fluorophore is excited by absorbing electromagnetic radiation at a wavelength in its absorption spectrum. As it relaxes, it emits light at a wavelength within its emission spectrum. For more information about fluorescence, see JoVE’s video on fluorescence microscopy. Different fluorophores absorb and emit light at different wavelengths, which frequently overlap. If the emission spectrum of a fluorophore overlaps significantly with the absorption spectrum of another fluorophore, the “donor” will release a virtual photon, which is absorbed by the “acceptor”. When an excited donor is within 10 nm of an acceptor, energy is transferred from donor to acceptor by dipole-dipole interactions. The release of energy by emission of light from the donor correspondingly decreases. Meanwhile, the excited acceptor emits light at its emission wavelength. The FRET response is evaluated in terms of efficiency, or the percentage of energy released from the donor by FRET rather than by fluorescence or other radiative processes. The efficiency depends strongly on the distance between the donor and acceptor, which allows FRET to act as a ‘molecular’ or ‘spectroscopic’ ruler.

In biochemistry, FRET is often used qualitatively to observe conformational changes in molecules by monitoring fluorophores as they move in and out of FRET range of each other. Similarly, cellular functions can be studied with molecules containing a FRET pair. If the labeled molecule is cleaved by enzyme activity, FRET stops and the observed fluorescence wavelength changes.

Now that you understand the principles behind FRET, let’s look at an overview of a protocol and a few ways to present and interpret the data.

Prior to the experiment, the biomolecules of interest, typically DNA or proteins, are engineered with fluorescent tags, using molecular biology techniques. Common ways to introduce the modified genetic material into the cells include transfection and electroporation.

Then, the cells are prepared for FRET visualization on a fluorescence microscope. For instance, the molecules may be immobilized on a slide for single-molecule FRET, or samples are loaded into wells for high-throughput screening.

Then, the excitation lasers, microscope, and associated equipment are prepared. (A) FRET experiments often involve powerful lasers; (B) so appropriate PPE and safety procedures should be used. The sample is then placed in the instrument and illuminated with the excitation laser.

For experiments monitoring cell behavior, color images showing differences or changes in emission intensity are used. Donor and acceptor emission intensities are plotted together to track FRET response over time.

FRET data can also be fitted to various functions for more complex analyses. Depending on the experiment, data may be presented in multiple ways to best represent the results, making FRET a flexible experimental tool.

Now that you’re familiar with the basics of running and analyzing a FRET experiment, let’s look at some applications of FRET in biochemistry research.

FRET can be used to study conformational changes or cellular processes by labeling parts of the protein or cell predicted to move within 10 nm of each other with a FRET pair. For example, protein sensors are prepared by labeling receptors with a pair of fluorophores. The FRET response is monitored live by confocal microscopy. Variation of emission wavelength and intensity indicate conformational changes.

FRET can also be used by preparing molecules with an active FRET pair and observing changes in the response. When the substrate is cleaved, FRET is disrupted, causing an increase in donor emission and a decrease in acceptor emission. The emissions are analyzed to determine contributions by donor, acceptor, and FRET. Once the direct emission factors are calculated for the cyan and yellow fluorescent proteins, the concentration and kinetic parameters of the substrate can be determined.

Cells designed to express monomers containing either of a FRET pair function as ‘sensors’ for interactions between those monomers. If aggregation of those monomers is induced, a FRET response is observed. This can be used to investigate protein aggregation triggered by ‘seeding’ of misfolded proteins. Here, cells were transduced with aggregates of the protein of interest, incubated, and analyzed with flow cytometry.

You’ve just watched JoVE’s video on Förster Resonance Energy Transfer, or FRET. This video contained the underlying principles of FRET, preparation and analysis of a FRET experiment, and a few biochemical applications.

Thanks for watching!

Tags

Cite This
JoVE Science Education Database. JoVE Science Education. Förster Resonance Energy Transfer (FRET). JoVE, Cambridge, MA, (2023).

Related Videos