Genetics
A subscription to JoVE is required to view this content.
You will only be able to see the first 2 minutes.
The JoVE video player is compatible with HTML5 and Adobe Flash. Older browsers that do not support HTML5 and the H.264 video codec will still use a Flash-based video player. We recommend downloading the newest version of Flash here, but we support all versions 10 and above.
If that doesn't help, please let us know.
Één druppel digitale Polymerase-kettingreactie voor alomvattende en gelijktijdige detectie van mutaties in Hotspot regio 's
Chapters
Summary September 25th, 2018
Please note that all translations are automatically generated.
Click here for the English version.
Hier presenteren we een protocol om meerdere genetische wijzigingen van een target gebied in een enkele reactie drop-off ddPCR met een unieke combinatie van hydrolyse sondes nauwkeurig te kwantificeren.
Transcript
Deze methode kan worden gebruikt als een diagnostisch instrument voor kanker om de circulerende tumor DNA te analyseren. Deze techniek ondervraagt meerdere genetische veranderingen in gebieden van clustermutaties in een enkele reactie. Dit helpt om kostbare patiëntmonsters te besparen.
Deze methode kan inzicht geven in de tumorbelasting op het mutatieprofiel. Het kan nu ook worden toegepast op een moleculaire analyse als alternatief voor qPCR om een absolute kwantificering van nucleïnezuur doelsequenties te verkrijgen. Verzamel bloedmonsters in zeven-milliliter EDTA buizen.
Twee buizen worden aanbevolen om ongeveer vier milliliter plasma te verzamelen. Centrifuge de bloedmonsters gedurende 10 minuten bij 820 keer zwaartekracht binnen drie uur na de bloedafname om rode bloedcellen, witte bloedcellen en plasma te scheiden. De tijd tussen de bemonstering en de centrifugatie is van cruciaal belang om hoogwaardig, T-celvrij DNA te verkrijgen dat niet besmet is met DNA dat vrijkomt uit witte bloedcellen.
Gebruik na centrifugatie een serologische pipet om de supernatant te verzamelen zonder de witte bloedcellaag aan te raken. Ongeveer twee milliliter plasma worden meestal teruggewonnen per EDTA buis. Na het overbrengen van de plasmen naar twee milliliter buizen, centrifugeren de aliquots op 16.000 keer de zwaartekracht gedurende 10 minuten op 15 graden Celsius om celpuin te verwijderen.
Verzamel het plasma zorgvuldig zonder de pellet te verstoren en breng over op twee milliliter cryogene buizen. Bewaar op negatieve 80 graden Celsius tot dat nodig is. Begin met het toevoegen van 400 microliter proteinase K aan een buis van 50 milliliter.
Voeg vervolgens vier milliliter plasma en 3,2 milliliter ACL lyse buffer met een microgram drager RNA uit de extractiekit. Sluit de buis en meng door vortexing voor 30 seconden om een homogene oplossing te verkrijgen. Dan, incubeer op 60 graden Celsius gedurende 30 minuten.
Voeg na de incubatie 7,2 milliliter buffer ACB toe aan het lysaat om de binding van de circulerende nucleïnezuren aan het silicamembraan te optimaliseren. Meng door vortexing voor 15 tot 30 seconden. Dan, incubeer de buis op ijs gedurende vijf minuten.
Bevestig de kolom en de 20 milliliter extender op de vacuümpomp. Sluit de ongebruikte porties om vacuüm aspiratie mogelijk te maken. Na het kort centrifugeren van de buis, voorzichtig het mengsel in de buis extender.
Schakel vervolgens de vacuümpomp in en laat het lysaat volledig door de kolommen worden getrokken. Verwijder en gooi de buis extender. Breng vervolgens 600 microliter buffer ACW1 aan op de kolom.
Wanneer buffer ACW1 door de kolom heeft getrokken, voeg 750 microliter acw2-buffer toe en ten slotte 750 microliter van 96 tot 100% ethanol. Plaats de kolom vervolgens in een schone opvangbuis van twee milliliter en vercentrifuge drie minuten op volle snelheid om ethanol te elimineren. Na het plaatsen van de kolom in een nieuwe twee milliliter opvangbuis, open het deksel en vervolgens incubeer op 56 graden Celsius gedurende 10 minuten om het membraan volledig te drogen.
Plaats de kolom na de incubatie in een schone 1,5 milliliter laagbindende buis. Breng voorzichtig 36 microliter RNase-vrij water aan met 0,04% natriumajaide. Sluit vervolgens het deksel en broed drie minuten op kamertemperatuur.
Centrifuge weer op volle snelheid voor een minuut om de nucleïnezuren te ontwijken. Dan, op te slaan op negatieve 20 graden Celsius tot dat nodig is. Begin met het ontdooien en equilibreren van de reactiecomponenten op kamertemperatuur in een schone PCR-kap.
Bereid vervolgens een 20 keer mix van primers en sondes in RNase en Dnase-vrij gedestilleerd water met elke primer op 18 micromolar concentratie en elke sonde op vijf micromolar concentratie. Voor alle individuele PCR reacties, bereid een monster mix door het combineren van 10 microliter van twee keer ddPCR Supermix, een microliter van 20 keer primers en sondes mix, en tot 10 nanogram van het DNA-monster in 20 microliter van gedestilleerd water. Vortex het reactiemengsel grondig om homogeniteit te garanderen.
En even centrifugeren om inhoud te verzamelen aan de onderkant van de buis voor het verstrekken. Steek de ddPCR-cartridge in de houder en laad 20 microliter monsterreactiemix in de middelste putten van de cartridge voor druppelgeneratie. Voeg 70 microliter druppelgeneratorolie toe aan de onderste putten.
Steek de cartridge met een pakking in de druppelgenerator. Druppels worden geproduceerd in de bovenste putten van de cartridge. Langzaam en voorzichtig 40 microliter van de druppels uit de cartridges aanzuigen en in een PCR-plaat met 96 putten af te geven.
Verzegel de uiteindelijke PCR-plaat met aluminiumfolie met behulp van een plaatafdichter onmiddellijk na het overbrengen van druppels om verdamping te voorkomen. Vercentrifugeert de plaat kort om de inhoud aan de onderkant van de putten te verzamelen. Voer een conventionele PCR-versterking uit op een thermische cycler.
Wanneer de run is voltooid, kort centrifugeren de plaat om inhoud te verzamelen aan de onderkant van de putten. Gebruik na PCR-versterking de druppellezer om pcr-positieve en PCR-negatieve druppels te tellen volgens de instructies van de fabrikant. De volgende zijn representatieve resultaten verkregen tijdens optimalisatiestappen van de drop-off ddPCR test.
Deze afbeelding toont detectie van mutant DNA en wild-type DNA in een reactie die 100% mutant DNA, 5% mutant DNA, en 100% wild-type DNA. Deze afbeelding toont voorbeelden van plasmamonsters geanalyseerd met de KRAS en EGFR drop-off ddPCR testen waaruit blijkt dat de detectie van enkele nucleotide en meerdere substituties in exon twee van KRAS en een schrapping in EGFR exon 19. Tijdens het proberen van deze procedure, is het belangrijk om zorgvuldig te werk te gaan bij elke stap met een speciale aandacht op de druppelgeneratie, dat is een kritieke stap van deze methode.
Na de ontwikkeling maakte deze techniek de weg vrij voor onderzoeker en clinicus op het gebied van kankeronderzoek om de tumormutatieanalyse te optimaliseren met behulp van vloeibare biopsie.
Related Videos
You might already have access to this content!
Please enter your Institution or Company email below to check.
has access to
Please create a free JoVE account to get access
Login to access JoVE
Please login to your JoVE account to get access
We use/store this info to ensure you have proper access and that your account is secure. We may use this info to send you notifications about your account, your institutional access, and/or other related products. To learn more about our GDPR policies click here.
If you want more info regarding data storage, please contact gdpr@jove.com.
Please enter your email address so we may send you a link to reset your password.
We use/store this info to ensure you have proper access and that your account is secure. We may use this info to send you notifications about your account, your institutional access, and/or other related products. To learn more about our GDPR policies click here.
If you want more info regarding data storage, please contact gdpr@jove.com.
Your JoVE Unlimited Free Trial
Fill the form to request your free trial.
We use/store this info to ensure you have proper access and that your account is secure. We may use this info to send you notifications about your account, your institutional access, and/or other related products. To learn more about our GDPR policies click here.
If you want more info regarding data storage, please contact gdpr@jove.com.
Thank You!
A JoVE representative will be in touch with you shortly.
Thank You!
You have already requested a trial and a JoVE representative will be in touch with you shortly. If you need immediate assistance, please email us at subscriptions@jove.com.
Thank You!
Please enjoy a free 2-hour trial. In order to begin, please login.
Thank You!
You have unlocked a 2-hour free trial now. All JoVE videos and articles can be accessed for free.
To get started, a verification email has been sent to email@institution.com. Please follow the link in the email to activate your free trial account. If you do not see the message in your inbox, please check your "Spam" folder.
