Biology
A subscription to JoVE is required to view this content.
The JoVE video player is compatible with HTML5 and Adobe Flash. Older browsers that do not support HTML5 and the H.264 video codec will still use a Flash-based video player. We recommend downloading the newest version of Flash here, but we support all versions 10 and above.
If that doesn't help, please let us know.
Saccharomyces cerevisiae Eksponentiel vækst kinetik i Batch kultur til at analysere respiratorisk og Fermentativ stofskifte
Chapters
Summary
Please note that all translations are automatically generated.
Click here for the English version.
Her præsenterer vi en protokol for at anslå den respiratoriske og Fermentativ metabolisme ved at montere den eksponentielle vækst af Saccharomyces cerevisiae eksponentiel vækst ligningen. Beregning af de kinetiske parametre giver mulighed for screening af påvirkninger af stoffer/forbindelser på gæring eller mitokondrie respiration.
Transcript
Denne metode kan hjælpe med at besvare centrale spørgsmål i de bioteknologiske og biomedicinske områder som, hvad der er det molekylære grundlag bag Warburg og Crabtree effekter. Den største fordel ved denne teknik er, at det giver mulighed for høj gennemløb undersøgelse af virkningerne af visse stoffer i respiratoriske og fermentative stofskifte. Begynd med at vaccinere et 15-milliliter konisk rør, der indeholder tre milliliter afkølet, steril 2% gær ekstrakt peptone dextrose, eller YPD bouillon, med 250 mikroliter af S.cerevisiae gær celler bevaret i glycerol ved negative 20 grader Celsius.
Inkuber gæren natten over i en orbital shaker ved 30 grader Celsius og 200 rpm. for striber på en 60-milliliter, 2% YPD agar-fyldt Petriskål næste morgen. Kultur skålen ved 30 grader Celsius indtil isolerede kolonier er observeret.
Derefter vaccinere en enkelt isoleret koloni i et nyt konisk rør, der indeholder 10 milliliter af cool, steril 2% YPD bouillon for natten kultur ved 30 grader Celsius med omrystning. For mikroplade vækst-kurve setup, tilsæt 145 mikroliter af en passende eksperimentel kulturelt medium til hver brønd af en steril 10-by-10 godt mikroplade med et låg og inokulere hver brønd med fem mikroliter af natten kultur. Derefter inkuberes multi-brøndpladen i en mikropladelæser ved 30 grader Celsius med konstant omrøring ved 200 omdrejninger i 48 timer og måler den optiske tæthed ved 600 nanometer hvert 30 eller 60 minutter.
Ved opstilling af ryk af konisk kolbevækstkurve podes 20 milliliterkoniske kolber indeholdende 4,8 milliliter af et passende sterilt kulturmedie med 200 mikroliter præ-inokulumkultur ved en optisk 600 nanometeroptisk tæthed på to til inkubation ved 30 grader Celsius og 250 omdr./min. Agitation ved 250 omdrejninger i minuttet er afgørende for at opnå en passende vækst i lave koncentrationer af kulstofkilder, der udøver respiratorisk vækst, som vi har observeret en reduceret gær vækst i luftvejssygdomme ved lavere agitation hastigheder. For at gøre det muligt at måle den optiske massefylde ved 600 nanometer hver anden time i 24 timer fortyndes 100 mikroliter af den rystede koniske kolbekultur i 900 mikroliter destilleret vand i en 1 millilitersspektrofotometer cuvette, og der blandes forsigtigt med pipetten.
Hvis du vil have databehandling, skal du oprette en ny projektfil i en passende statistisk pakkesoftware, åbne den nye tabel- og grafmenu og vælge XY. Vælg start med en tom datatabel og et punkt og et forbindelseslinjediagram under eksempeldatamenuen. Lad X-sektionen være umarkeret i underkolonner for replikerer eller fejlværdier. I afsnittet Y skal du vælge angiv 10 replikerede værdier i side om side-underkolonner og afbilde middelværdi og fejl SD. Klik derefter på opret.
Angiv det tidspunkt, hvor OD-målingerne blev opnået i kolonnen X og od-værdierne fra kulturerne i Y-kolonnen. Hvis du vil identificere den eksponentielle vækstfase, der omdanner Y-kolonnedataene til logaritmer, skal du klikke på Analyser og vælge transformeringsanalysen. Brug Y er lig med log Y til at vælge Y-værdierne og åbne galleriet med resultater.
Vælg transformeringsdatatabellen, klik på Analysér, og vælg den lineære regressionsanalyse, bortset fra de optiske tæthedsværdier, der ikke følger en lineær tendens, ved at markere værdierne i tabellen og trykke på kontrolelementet og E.In datatabelgalleriet, markere dataene én tabel og klikke på Analyser. Vælg den ikke-lineære regressionskurve, der passer til, og de datasæt, der skal analyseres, og klik på OK. Anvend derefter mindst firkanter, der passer til dataene, så den interpolerede sektion ikke er markeret, og klik på OK. Åbn derefter en ny projektfil, og vælg kolonnevalget i den nye tabel- og grafmenu, start med en tom datatabel og den ønskede graf. Indstil grafen til at afbilde middeltingen med standardafvigelsen, og klik på opret.
Kopiér middel- eller deltatidsværdierne fra tabellen ikke-lineære tilpasningsresultater i resultatgalleriet, og indsæt dataene i en kolonne. Endelig skal du klikke analysere og vælge analysen af interesse i kolonneanalyse menuen for at sammenligne de kinetiske parametre for de forskellige næringsbetingelser. Vækstkinetiske tærskelværdier varierer mellem styrker og skal evalueres i henhold til de forhold, vi bruger i analysen.
Kulturer, der demonstrerer en fermentativ fænotype, har en lille lagfase og en eksponentiel fase med en høj vækstrate. Kulturer, der opnår energi hovedsageligt ved oxidativ fosforylering udviser en længere forsinkelse fase med en langsom vækstrate i den eksponentielle fase. Beregning af den specifikke vækstrate og fordoblingstiden for vækstkurverne ved hjælp af den eksponentielle vækstligning giver mulighed for at fastsætte tærskler for de respiratoriske og fermentative vækstværdier.
For eksempel, i disse repræsentative eksperimenter, virkningerne af forskellige resveratrol koncentrationer på S.cerevisiae BY4742 celler afslører ændring af cellen energiske status som reaktion på varierende glukose koncentrationer. Her, tilskud med 10% glukose viser, at lavere koncentrationer af ammonium favor fermentativmetabolisme som det fremgår af en udvidet eksponentiel vækstfase i disse kulturer, mens en højere koncentration inducerer en respiro-fermentativ metabolisme som det fremgår af en udvidet lag fase og en langsommere vækstrate i den eksponentielle fase. Endelig kan der observeres solide forskelle i fermentative fordoblingstidsværdier mellem disse to forskellige gærstammer, der dyrkes under de samme betingelser, hvilket understreger nødvendigheden af at validere fordoblingstærsklen for hver analyseret stamme.
Under forsøg på denne procedure er det vigtigt at huske, at denne protokol kun bruges til at frasløre fænotype. De specifikke virkninger på respiration og gæring skal bekræftes ved henholdsvis oxygenforbrugsanalyser eller ved akkumulering af henholdsvis gærings biprodukter.
Tags
Biologi sag 139 Saccharomyces cerevisiae vækst kinetik eksponentiel fase batch kulturer eksponentiel vækst ligning mitokondrie respiration gæringRelated Videos
You might already have access to this content!
Please enter your Institution or Company email below to check.
has access to
Please create a free JoVE account to get access
Login to access JoVE
Please login to your JoVE account to get access
We use/store this info to ensure you have proper access and that your account is secure. We may use this info to send you notifications about your account, your institutional access, and/or other related products. To learn more about our GDPR policies click here.
If you want more info regarding data storage, please contact gdpr@jove.com.
Please enter your email address so we may send you a link to reset your password.
We use/store this info to ensure you have proper access and that your account is secure. We may use this info to send you notifications about your account, your institutional access, and/or other related products. To learn more about our GDPR policies click here.
If you want more info regarding data storage, please contact gdpr@jove.com.
Your JoVE Unlimited Free Trial
Fill the form to request your free trial.
We use/store this info to ensure you have proper access and that your account is secure. We may use this info to send you notifications about your account, your institutional access, and/or other related products. To learn more about our GDPR policies click here.
If you want more info regarding data storage, please contact gdpr@jove.com.
Thank You!
A JoVE representative will be in touch with you shortly.
Thank You!
You have already requested a trial and a JoVE representative will be in touch with you shortly. If you need immediate assistance, please email us at subscriptions@jove.com.
Thank You!
Please enjoy a free 2-hour trial. In order to begin, please login.
Thank You!
You have unlocked a 2-hour free trial now. All JoVE videos and articles can be accessed for free.
To get started, a verification email has been sent to email@institution.com. Please follow the link in the email to activate your free trial account. If you do not see the message in your inbox, please check your "Spam" folder.
