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陰イオン交換器 (ジエチルアミノエチル セルロース列) による血中からのアフリカを含む細胞外の Trypanosomes の精製
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Summary April 6th, 2019
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トリパノソーマ血から分離のこの方法は、哺乳類の血液細胞よりも小さい負となりその表面電荷に依存します。感染した血は配置し、陰イオン交換カラムに扱われます。このメソッド、アフリカ睡眠病の最もフィッティング診断は、免疫学的、生物学的、生化学的、薬学・分子生物調査のため精製の寄生虫を提供します。
Transcript
アフリカのトリパノソームは、ヒトアフリカのトリパノソマイア症、または睡眠病および動物アフリカのトリパノソイア症を担当しています。睡眠病を引き起こすトリパノソームは、サハラ以南のアフリカの多くの地理的な病巣に存在するツェツェハエ伝染性の原虫である。寄生虫の検出は、診断、治療、およびフォローアップに不可欠です。
血清学は偽陽性を与え、残念ながら、偽陰性の結果を与えることができます。血液中の検出を助けるためには、トリパノソームを濃縮する必要があります。種々の寄生虫濃度技術が用いられてきた。
最も敏感な方法は、アニオン交換器の列による血液からの寄生虫の分離であり、DEAEセルロースは遠心分離および顕微鏡観察が続く。その結果、DEAEセルロース法は、ヒトアフリカのトリパノソサイト症診断のために、特にフィールド条件において、血液から寄生虫を可視化および単離するための最良かつ現在に残っている。この方法は、アフリカのトリパノソミア症に最も適合する診断薬で、免疫学的、生物学的、生化学的、医薬的、および分子生物学的調査のための精製寄生虫を提供する。
実験動物のケアと使用のためのガイドに準拠したすべての調査は、フランス当局から取得されており、使用されるすべてのプロトコルは、私たちの地元の倫理委員会によって承認されています。書かれたプロトコルに従って各物質を計量します。蒸留水を加え、pH 8に正確に調整し、リン酸二水素カリウムで、次の緩衝溶液、濃縮リン酸緩衝液生理食塩水2Xを作ります。
リン酸緩衝生理食塩水グルコースに蒸留水とグルコースを加えます。溶出バッファーの 100 ミリリットルの場合は、ペニシリン 1 ミリリットルあたり 100 単位、ストレプトマイシンのミリリットルあたり 100 マイクログラム、フェノールレッドの 5 マイクログラムミリリットルをリン酸緩衝生理食塩水グルコースに追加します。100グラムのDEAEセルロースは、まず3リットルの蒸留水で洗浄し、次に沈静化する。
微粒子は廃棄されます。上清がはっきりするまで、この清水を繰り返します。濃縮リン酸緩衝食塩水2Xを添加し、DEAEセルロースを攪拌する。
pHは1つのリン酸モルカリウムで8に調節される。セルロースは、次いで蒸留水で2回洗浄し、リン酸緩衝生理食塩水グルコースで2回洗浄する。DEAEセルロースとリン酸緩衝生理食塩水グルコースは等量で混合される。
合金は四分の一し、長期貯蔵のために室温または4度摂氏またはマイナス20°Cで貯蔵される。トリパノソーム感染した血液は液体窒素に保存されます。1ミリリットルの合金クォートは室温で解凍されます。
寄生虫は、針と1ミリリットルの注射器を使用してクライオチューブから慎重に収集されます。解凍された寄生虫の生存率は、感染前の光顕微鏡観察によって可視化された運動性によって評価される。寄生虫は、マウス1匹あたり500マイクロリットルの2匹のマウスの腹腔内に注入される。
毎日感染後、寄生虫血症は針で尾から血液の滴を集めることによって評価され、顕微鏡検査によってチェックされる。寄生虫症が適切なレベルにある場合、感染した血液が収集される。10ミリリットルのシリンジはクランプまたはホルダーで支え、フィルターペーパーのプレカット部分が加えられている。
調製されたDEAEセルロースは、8または9ミリリットルのレベルまでシリンジに注がれる。カラムは溶出バッファーで洗浄される。感染した血液の2ミリリットルは慎重にカラムの上に置かれ、トリパノソームは50ミリリットル遠心チューブのカラム溶出物中に集められる。
溶出緩衝液は、トリパノソームの通過に応じて定期的に添加される。カラムを通るトリパノソームの通過は、一定の間隔でカラム溶出物を一滴採取し、光顕微鏡を用いてトリパノソームを観察することによってチェックされる。ルアート中にトリパノソームが観察されなくなると、円錐管は摂氏4度で10分間1,800倍Gで遠心する。
上清は捨てられ、パレットのトリパノソームはヘモサイトメーターで数えられる。収集されたトリパノソームは、その後、計画的な調査に必要な培地で希釈される。この方法は、アフリカのトリパノソミア症に最も適合する診断薬で、免疫学的、生物学的、生化学的、医薬的、および分子生物学的調査のための精製寄生虫を提供する。
これらの研究は、DEAEセルロース精製寄生虫が、自然にまたは実験的に感染した宿主、特にげっ歯類から大量に得られやすいために開発された。医薬薬剤の存在下でのトリパノソームの生存率は、顕微鏡観察によって評価される。寄生虫の生存率は運動性に関連しており、したがって、40倍以上の倍率で光顕微鏡下で眼でチェックすることができる。
寄生虫の生存率は、運動形態の割合を測定することによって評価される。試験化合物の希釈は96ウェル組織培養プレートの各ウェルに添加され、対照ウェルはmock処理される。各濃度は三重で評価される。
各希釈のための生存可能な寄生虫の数は、コントロールウェル内の寄生虫の数と比較されます。ヒトアフリカのトリパノソマイア症療法で使用される参照薬であるペンタミジンの効果をこの図に示す。トリパノソームマクロファージ共培養は、細胞レベルでの宿主寄生虫相互作用の調査を可能にする。
マクロファージパラサイトの共同培養では、細胞外トリパノソームはアルギニンをオルニチンに加水分解するマクロファージアルギナーゼの産生を誘導する。オルニチンは、ポリアミンとトリパノチオンの前駆体であり、寄生虫の生存と成長に不可欠です。さらに、アルギニン枯渇はトリパノサイド一酸化窒素の生成を減少させる。
続いて、アルギナーゼ阻害剤を添加し、共培養にS-L-システインを添加すると、マクロファージ誘導寄生虫の増殖が劇的に減少する。アルギナーゼ誘導は、トリパノソーム排泄および分泌因子によって媒介される。このアルギナーゼ誘導因子は、オルチンキネシンとして同定されている。
キネシンはC型レクチンマンノース結合受容体に結合する。アルギナーゼは誘導され、寄生虫の成長を支持するオルニチンを生成します。.アルギナーゼは、12.5ミリモルマンノースで培養されたマクロファージや、マクロファージマンノース受容体が削除されたマウスのマクロファージにおいてキネシンによって誘導されない。
さらに、Bilbo1などの新規細胞骨格タンパク質が同定された研究で、DAEAセルロース精製トリパノソームを用いた細胞生物学および生化学的実験の例が実証されている。BILBO1は、重要な細胞骨格構造および寄生虫生存の生物形成に必要である。したがって、BILBO1は病原性トリパノソームへの介入の重要な標的を表す。
血流培養形態の免疫蛍光標識を示す画像を、抗BILBO1抗体でプローブしたトリパノソーマ・ブセオシ細胞をこの図に示す。さらに、糖およびスレオンニン代謝は、DEAEセルロース精製トリパノソームを用いて説明されており、これらのプロセスに関与する酵素が実験的に検証されている。血流形成トリパノソームにおけるグルコースおよびスレオンニン代謝の概略表現をこの図に示す。
最近の改善とDEAEセルロースカラムを交換することにより、血液からアフリカのトリパノソームを精製することは、固有の領域で低い寄生虫を持つ天然宿主だけでなく、実験的な調査のために多数の寄生虫の要件においても、トリパノソーム検出のゴールドスタンダードのままです。調査は、寄生虫の生存と成長に不可欠な役割を果たしているトリパノソーム分子の同定を可能にしました。同定された標的は、1つの健康アプローチでヒトと動物の両方に潜在的な抗原を持つ将来のワクチンの基礎を表す可能性がある。
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