Journal
/
/
Gene Expression analyse av endotelceller utsatt for skjæring Stress ved hjelp av flere parallelle-plate flyt Chambers
JoVE Journal
Bioengineering
A subscription to JoVE is required to view this content.  Sign in or start your free trial.
JoVE Journal Bioengineering
Gene Expression Analysis of Endothelial Cells Exposed to Shear Stress Using Multiple Parallel-plate Flow Chambers

Gene Expression analyse av endotelceller utsatt for skjæring Stress ved hjelp av flere parallelle-plate flyt Chambers

8,887 Views

08:50 min

October 21, 2018

DOI:

08:50 min
October 21, 2018

6 Views
, , , , ,

Transcript

Automatically generated

Denne metoden kan bidra til å svare på viktige spørsmål innen endotelbiologi, for eksempel hvorfor har blodkar regionale forskjeller i utviklingen av aterosklerose? Den største fordelen med denne teknikken er at den tillater samtidig studie av flere forhold under skjærstress eller flere skjærstressforhold. Implikasjonene av denne teknikken strekker seg mot å forstå endotelgenregulering i både arterielle og venøse systemer fordi ulike strømningshastigheter og mønstre kan brukes.

Vel her demonstrerer vi et system som bruker jevn laminær flyt. Oppsettet kan tilpasses andre strømningsmønstre, inkludert forstyrret flyt. Generelt vil personer som er nye på denne metoden, slite med å opprettholde et kontinuerlig monolag av celler gjennom hele eksperimentets varighet og for å oppnå konsistente resultater mellom eksperimenter.

24 timer før analysen teller du de menneskelige endotelcellene ved en tidlig passasje og frø omtrent en ganger 10 til de sjette cellene i en milliliter medium på en fibronectin belagt glasssklie per brønn av en firebrønns cellekulturplate. La cellene holde seg til lysbildet i 15 minutter ved 37 grader Celsius. Dekk deretter hvert lysbilde med tre milliliter medium og legg platen i cellekulturinkubatoren på 37 grader Celsius og 5% CO2 i 24 timer.

På dagen for eksperimentet fyller du vannbrettet i et stort, oppvarmet, innebygd miljø med justerbar CO2 og varme, eller strandinkubator, med flere hyller, intern tilgang til elektrisitet og glassdører, og bekrefter at tilstrekkelig karbondioksid er tilgjengelig for eksperimentet, og at CO2-skjermen er funksjonell. For å sette opp strømningskammeret, sett inn en 1/8 tommers kvinnelig lokke inn i den ene enden av et nummer 16 mykt rør, og fest en fireveis stoppekran til lokke. Fest den frie enden av røret til tilstrømningssiden av topplaten og sett inn en 1/8th tommers hann lokke inn i den ene enden av et sekund nummer 16 mykt rør.

Fest en fireveis stoppekran til hannlokken, og fest den frie enden av røret til utløpssiden av topplaten. Sett inn en 1/8th tommers mannlig lokke og en 1/8th tommers kvinnelig lokke inn i hver ende av en tredje nummer 16 myk rør, og fest slangen til en boble felle via 1/8th tommers mannlig lokke. Fest deretter en fireveis stoppekran til den andre enden av slangen via den kvinnelige lokke.

Ved hjelp av sterile pinsett, overføre en celle seeded glass lysbilde til utsparingen på bunnplaten, celle seeded side opp. Bruk en 10 milliliter sprøyte til å tilsette 10 milliliter varmt medium til bunnplaten i den røde pakningslinjen rundt platen. Slik at medium kan strømme gjennom lysbildet og dekke cellene.

Plasser toppplaten forsiktig på bunnplaten, og ta vare på sidene og skru platene godt sammen. For å fjerne luftbobler fra boblefellen, først åpne tilsig og boble felle stoppekraner og lukke utstrømningsstoppkranen. Bruk deretter en 30 milliliter sprøyte til å forsiktig skylle 20 milliliter varmt medium gjennom platen.

For å fjerne bobler fra kammeret, lukk boblefellestoppkranen og åpne utløpsstoppkranen. Løft utløpssiden av kammeret til en 45 graders vinkel og bruk 30 milliliter sprøyten til å forsiktig skylle 20 milliliter varmt medium fra tilsigssiden av kammeret. Det er viktig å skylle med en passende hastighet i retning av strømmen og å bruke mikroskop for å bekrefte at en samtidig monolayer av celler forblir før de utsetter cellene for laminærstrømmen.

Lukk deretter stoppekranene på begge sider av kammeret og hetten og bekreft at cellene fortsatt er festet til lysbildet under et lett mikroskop. Plasser strømningskammeret og et tidligere montert strømningssløyfesystem inn i stranden og reduser pumpehastigheten til strømningssløyfeenheten langsomt før pumpen settes helt på pause. Lukk stoppekranene på strømningssløyfesystemet for å forhindre lekkasje og koble kammeret og sløyfesystemet sammen via stoppekraner.

Når alle løkkene er koblet til, åpner du alle stoppekranene igjen og øker pumpehastigheten langsomt mens du overvåker oppsettet for lekkasje eller blokkering. Plasser strømningssensoren på kammerbroslangen på tilsigsiden av kammeret med sensoren orientert i strømningsretningen og juster pumpehastigheten for å oppnå strømningshastigheten for skjærstresshastigheten. Slå deretter på CO2-tanken for å oppnå en konsentrasjon på 5 %C02.

Når den eksperimentelle strømningsperioden er fullført, reduser den peristaltiske pumpehastigheten langsomt til null og slå av strømmen. Lukk raskt alle åpne stoppekraner og overfør kammeret og de vedlagte slangene med en stoppekran på hver side til en ren benkeplate. Skru forsiktig av alle skruene for å fjerne topplaten og bruk nålenese pinsett til å overføre glasssklien fra bunnplaten til en 100 millimeter diameter rett.

Vask lysbildet i 10 milliliter kald PBS og kontroller cellene under et mikroskop for å bekrefte celleetterlevelse og justering i strømningsretningen. Etter aspirering av PBS, overfør lysbildet til en ren 100 millimeter diameter tallerken og tilsett 350 mikroliter lysis buffer supplert med 1/100th av Beta-Mercaptoethanol fra en RNA ekstraksjon kit til lysbildet. Bruk en polyetylenbladed celleskraper til å skrape cellene av lysbildet og vippe vevskulturfatet slik at bufferen kan slå seg sammen nederst.

Bruk tang til å fjerne lysbildet og pipette cellen lysate inn i en 1,5 milliliter tube på is. Deretter legger du til 10 mikroliter fortynnet luciferase RNA til cellelylat for nedstrøms RNA-isolasjon og analyse i henhold til standardprotokoller. En vellykket linearisering av luciferase plasmid ved hjelp av begrensningsenzymer kan bekreftes ved å kjøre de fordøyde produktene på en agarosegel og størrelsen på det lineære produktet kan bekreftes med DNA-stiger og sammenlignet med en uklippet plasmid.

Produksjonsprosesser kan føre til små variasjoner i kammerhøyden, og dermed må strømningshastigheten beregnes for hvert kammer for å oppnå samme skjærstress. For eksperimenter som omfatter laminær skjærstress i pattedyr endotelceller, kan firefly luciferase RNA brukes som en eksogen RNA spike-in. Normalisering av det endogene referansegenet, det eksogene referansegenet, og både endogene og eksogene referansegener gir sammen lignende resultater.

Merk, i disse representative eksperimentene ved hjelp av to samtidig kjører flytkamre med skjær stress på en Pascal for hvert eksperiment, Kruppel som faktor to knockdown via SI-RNA ga en lignende knockdown effektivitet mellom de testede biologiske prøvene. Mens du prøver denne prosedyren er det viktig å huske å etablere en jevn monolayer av celler på lysbildet og å rikelig strømningssløyfesystemet før du fester strømningskammeret. Etter denne prosedyren kan andre metoder, som RNA-sekvensering, brukes til å vurdere genom bredt RNA-uttrykk og andre avlesninger, som DNA og protein, kan brukes til ytterligere molekylær analyse.

Etter utviklingen banet denne teknikken vei for forskere innen endotelbiologi for å utforske forholdet mellom skjærstress og angiogent potensial i menneskelige endotelceller.

Summary

Automatically generated

Her vises en arbeidsflyt for kultur og gene expression analyse av endotelceller under væske skjæring stress. Inkludert er en fysisk arrangement for boliger og overvåke flere flyt kamre i et kontrollert miljø og bruk av en ytre referanse for kvantitative PCR samtidig.

Read Article