Login processing...

JoVE Journal
Bioengineering

A subscription to JoVE is required to view this content.
You will only be able to see the first 2 minutes.

JoVE Journal Bioengineering

Tillverkning av cell-lösa brosk-derived Matrix ställningar

Fabrication of Gradient Nanopattern by Thermal Nanoimprinting Technique and Screening of the Response of Human Endothelial Colony-forming Cells

Journal (Bioengineering)

Fabrication of Gradient Nanopattern by Thermal Nanoimprinting Technique and Screening of the Response of Human Endothelial Colony-forming Cells

Haptic/Graphic Rehabilitation: Integrating a Robot into a Virtual Environment Library and Applying it to Stroke Therapy

Journal (Bioengineering)

Haptic/Graphic Rehabilitation: Integrating a Robot into a Virtual Environment Library and Applying it to Stroke Therapy

Click here for the English version

Tillverkning av cell-lösa brosk-derived Matrix ställningar

Article DOI: 10.3791/58656-v

January 7th, 2019 •

Kim E.M. Benders¹, Margo L. Terpstra¹, Riccardo Levato¹, Jos Malda^1,2

¹Department of Orthopedics, University Medical Center Utrecht, The Netherlands, ²Department of Veterinary Medicine, Equine Surgery, University of Utrecht, The Netherlands

Chapters

Summary
Automatic Translation

English (Original)
العربية (Arabic)
中文 (Chinese)
dansk (Danish)
Nederlands (Dutch)
français (French)
Deutsch (German)
עברית (Hebrew)
हिंदी (Hindi)
italiano (Italian)
日本語 (Japanese)
한국어 (Korean)
norsk (Norwegian)
português (Portugese)
русский (Russian)
español (Spanish)
svenska (Swedish)
Türkçe (Turkish)

January 7th, 2019

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the English version.

Cell-lösa brosk-derived ställningar kan användas som en byggnadsställning till guide brosk reparation och som ett sätt för att regenerera osteokondrala vävnad. Detta dokument beskriver hur decellularization i detalj och ger förslag att använda dessa ställningar i in vitro-inställningar.

Transcript

Denna metod presenterar ett sätt att skapa byggnadsställningar som härrör från inhemska vävnad som kan användas för brosk regenerering. Den största fördelen med denna teknik är att komponenter i inhemska brosk bevaras i de byggnadsställningar som kan främja broskbildning och regenerering in vitro och in vivo. Även om dessa metod använder brosk från häst kväva leder, brosk från alla andra leder kan användas också.

Till att börja, erhålla en intakt cadaveric gemensamma för brosk isolering och ta bort huden överflödigt fett och muskelvävnad som beskrivs i den medföljande textprotokoll. Därefter definierar den plats där leden artikulerar genom att utföra förlängning böjning av leden. Gör ett horisontellt snitt för att nå ledhålan.

Därefter gör en vertikal snitt för att öppna upp det gemensamma området. Den gemensamma håligheten är fylld med ledvätska som sannolikt kommer att droppa från hålrummet när de utför av korrekt snitt. Fortsätt att öppna upp leden helt genom att ta bort alltför fett, muskler och senor, och genom att skära genom senor som håller leden tillsammans.

Inspektera försiktigt brosket för eventuella makroskopiska skador. Om ledbrosket inte har en glossier slät utseende eller om bevis, blåsor, klyftor eller defekter är närvarande, kassera brosk och börja om igen. Använd en steril skalpell för att ta bort brosket från benet.

Skär hela vägen ner till subkondral ben för att ta bort den djupa zonen brosk. Samla de borttagna broskskivorna i 50 milliliterrör som innehåller tidigare beredd brosktvättlösning. Samtidigt som bearbetas, regelbundet droppa brosk tvättlösning på brosk för att förhindra att brosket torkar ut.

Efter att ha samlat brosket från alla de områden av intresse, snap frysa brosk skivor i flytande kväve i fem minuter. Överför sedan broskskivorna i 50 milliliterrör och placerade omedelbart de frysta skivorna i en frystork. Lyofilisera brosket skivor i 24 timmar med frystork.

När du är klar, förvara frystorkade broskskivor på en torr plats vid rumstemperatur. För manuell bearbetning, pre chill a mortel och mortelstöt med flytande kväve, sedan placera lyofiliserade brosk skivor i mortel och dränka dem och flytande kväve. Slipa direkt proverna för hand i cirka 45 minuter tills de är tillräckligt pulveriserade.

Alternativt, för att slipa proverna automatiskt med hjälp av en fräsmaskin, börja med att förkyla fräsmaskinens slipfack genom att tillsätta flytande kväve. Tillsätt sedan lyofilaterade broskskivor och fräs provet med sin förinställda hastighet i några sekunder upp till en minut. Se till att alla partiklar är slipade och att inga partiklar stannar i botten av slipfacket.

Slutligen, följa med decellularization tekniken som beskrivs i den medföljande text protokollet innan bildar byggnadsställningar. Överför brosket partiklar med en liten etikett till en cylindrisk plast mögel. Tryck alla luftbubblor ut för att undvika håligheter i ställningen och fyll formen helt.

För att undvika håligheter i ställningenS, se till att luftbubblor pressas ut medan du fyller formen med broskpartiklar. Efter bildandet, frysa formen i 10 minuter vid minus 20 grader Celsius. Sedan lyophilize broskställningarna inom formen i 24 timmar i en frystork.

Efter lyofilisering, ta försiktigt bort byggnadsställningen från formen. Placera ställningen under en 365 nanometer våglängd UV-ljus och tvärlänka den över natten. Bilda byggnadsställningsskivor genom att skära steriliserade byggnadsställningar i tre millimeter tjocka skivor.

Överför sedan byggnadsställningarna i separata brunnar på en sex brunnsplatta. Tillsätt en milliliter Chondrocyte Expansion Medium ovanpå ställningar och låt dem rehydrera i 30 minuter. Medan byggnadsställningarna rehydrerar, förbereda cellerna och pipetten 50 mikroliter av den förberedda cellupphängningen ovanpå den preindränkta byggnadsställningen.

Sedan inkubera ställningen i en timme vid 37 grader Celsius. När du använder kondrocyter, se till att de inte har utökats förbi den första passagen i syfte att minimera antalet differentierade celler. Efter en timme, returnera plattan till kulturhuven och försiktigt vända ställningen över.

Pipettera de återstående 50 mikroliter av cellupphängning på byggnadsställningen och inkubera ytterligare en timme vid 37 grader Celsius. Tillsätt efter inkubation tre milliliter medium till brunnarna med byggnadsställningar. Undvik pipettering av mediet direkt på ställningar och hantera odlingsplattan försiktigt för att undvika att cellerna lossnar.

Lämna tillbaka plattan till inkubatorn och odlingscellen överlät byggnadsställningar vid 37 grader Celsius. En kombination av historlogiska färgning och DNA-kvantifiering har använts för att visa att de metoder som presenteras i denna artikel resultera i tillräckliga brosk byggnadsställning decellularization. De resulterande byggnadsställningar befanns innehålla inga celler tillsammans med omätbara nivåer av DNA.

De saknar också glykosaminoglykaner och är rika på kollagen II.Här observeras neomatrisbildning på byggnadsställning som översades med mesenkymala stamceller som var odlade i fyra veckor. Bildandet av glykosaminoglykaner är rikligt efter fyra veckor. Efter försök med den här proceduren är det viktigt att undersöka om decellularization har lyckats, innan du använder den i något program.

Efter detta förfarande, ytterligare biokemiska analys som Western blot analysator kan utföras i syfte att svara på specifika frågor om förekomsten av andra komponenter såsom tillväxtfaktorer. Denna teknik banade väg för forskare inom vävnadsteknik att utforska strategier för broskregenerering med hjälp av decellulerad vävnad från allogena och syngeneiska källor. Försiktighetsåtgärder som att bära en labbrock och handskar bör alltid vidtas.

X

Simple Hit Counter