Biochemistry
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मानव लिपिड के प्रति संवेदनशील कटियन चैनल TRPC3 के एकल कण क्रायो-इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी द्वारा संरचनात्मक निर्धारण के लिए अभिव्यक्ति और शुद्धि
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इस प्रोटोकॉल क्रायो-इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी द्वारा आयन चैनल संरचनाओं का निर्धारण करने के लिए इस्तेमाल तकनीक का वर्णन करता है, एक baculovirus प्रणाली कुशलतापूर्वक न्यूनतम प्रयास और विषाक्तता, प्रोटीन निष्कर्षण, शुद्धि के साथ स्तनधारी कोशिकाओं में जीन व्यक्त करने के लिए इस्तेमाल किया सहित, और गुणवत्ता की जांच, नमूना ग्रिड तैयारी और स्क्रीनिंग, साथ ही साथ डेटा संग्रह और प्रसंस्करण ।
Transcript
इस प्रोटोकॉल ने हमें मानव TRPC3 की संरचना को हल करने में सक्षम बनाया, जो एक महत्वपूर्ण का सदस्य है, लेकिन आयन चैनलों के कम अध्ययन परिवार। इस तकनीक का मुख्य लाभ उच्च दक्षता है जिसके साथ इसे संरचनात्मक और कार्यात्मक अध्ययन दोनों के लिए विभिन्न प्रकार के प्रोटीन को व्यक्त और शुद्ध करने के लिए लागू किया जा सकता है। यह विधि प्रोटीन बायोकेमिस्ट्री और बायोफिजिक्स का अध्ययन करने में उपयोग के लिए एक कुशल प्रोटीन अभिव्यक्ति और शुद्धिकरण प्रणाली प्रदान कर सकती है और विभिन्न प्रकार के आयन चैनलों और अन्य झिल्ली प्रोटीन पर लागू की जा सकती है।
सबसे पहले, वायरस के जीएफपी फ्लोरेसेंस को देखने के द्वारा सापेक्ष वायरस अभिव्यक्ति की जांच करें जो वायरस उत्पादक संस्कृति के नमूने में है। पर्याप्त आकार के एक चकित नीचे एर्लेनमेयर संस्कृति फ्लास्क में, अभिव्यक्ति माध्यम में 3.5 से 3.8 मिलियन कोशिकाओं प्रति मिलीलीटर की एकाग्रता पर, एक एचईके 2 9 3 स्तनधारी सेल सस्पेंशन संस्कृति की वांछनीय मात्रा तैयार करें, जो 1% बाँझ एफबीएस के साथ पूरक है। तैयार P2 वायरस स्टॉक समाधान की मात्रा से 8% जोड़ें और ३७ डिग्री सेल्सियस और १३५ आरपीएम पर एक कक्षीय शेखर में इनक्यूबेट ।
संक्रमण के बाद 12 से 18 घंटे में 10 मिलीमोलर सोडियम ब्यूटारेट जोड़ें, इष्टतम प्रोटीन अभिव्यक्ति के लिए आवश्यक समय की मात्रा के लिए 30 डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेट करें। इसके बाद कोशिकाओं की कटाई के लिए 20 मिनट के लिए 2, 880 बार गुरुत्वाकर्षण पर अपकेंद्रित्र। काटा गया कोशिकाओं के प्रति लीटर टीबीएस के लगभग 100 मिलीलीटर में कोशिकाओं को धोएं और फिर से रखें।
20 मिनट के लिए 2, 880 बार गुरुत्वाकर्षण पर फिर से सेंट्रलाइज करें और सेल पेलेट को इकट्ठा करें। इसके अलावा अलग-अलग समय बिंदुओं पर छोटे, एक मिलीलीटर सेल पैलेट हार्वेस्ट एकत्र करें और विभिन्न डिटर्जेंट और/या एडिटिव्स की उपस्थिति में आंदोलन के साथ चार डिग्री सेल्सियस पर दो घंटे के लिए घुलनशील करें । अल्ट्रासेंट्रफ्यूगेशन द्वारा इन छोटे पूरे सेल सोल्यूबिलाइज्ड नमूनों को 235, 000 बार गुरुत्वाकर्षण और 10 मिनट के लिए चार डिग्री सेल्सियस पर स्पष्ट करें।
फिर, अभिव्यक्ति के लिए सबसे अच्छा समय और सबसे अच्छा घुलनशीलता शर्तों का निर्धारण करने के लिए, उन्हें एसईसी क्रोमेटोग्राफी कॉलम पर 30 माइक्रोलीटर नमूनों के रूप में चलाएं। काटा कोशिकाओं के प्रति लीटर बफर के १०० मिलीलीटर में गोली गल । एक बार जब कोशिकाओं को गल जाता है, तो समाधान सुनिश्चित करने के लिए उन्हें पिपेट करें या हिलाएं।
कोशिकाओं को एक हलचल बार से उभारा जा रहा है, जबकि दो घंटे के लिए बर्फ में डूबे एक बीकर में चार डिग्री सेल्सियस पर घुलनाशील । इसके बाद, अल्ट्रासेंट्रफ्यूगेशन द्वारा किसी भी सेल मलबे को 235, 000 बार गुरुत्वाकर्षण और एक घंटे के लिए चार डिग्री सेल्सियस पर हटा दें। प्रोटीन की मात्रा को सत्यापित करने और जीएफबी सिग्नल आउटपुट द्वारा लक्षित प्रोटीन की कल्पना करने के लिए एचपीएलसी द्वारा एससीसी कॉलम पर सुपरनेट का 30 माइक्रोलीटर नमूना चलाएं।
कोबाल्ट एफ़िनिटी राल बंधे सुपरनेटेंट को गुरुत्वाकर्षण स्तंभ पर लागू करें और प्रवाह के माध्यम से एकत्र करें। प्रोटीन को सत्यापित करने के लिए एक एससीसी कॉलम पर प्रवाह के माध्यम से एक 30 माइक्रोलीटर नमूना चलाने राल के लिए बाध्यकारी है । फिर, बफर के 10 कॉलम वॉल्यूम के साथ राल धोएं।
प्रोटीन हानि की जांच के लिए एससीसी कॉलम पर वॉश का 30 माइक्रोलीटर सैंपल चलाएं । बफर का उपयोग करना, राल बाध्य मानव TRPC3 elute। एक एसएससी कॉलम पर एक से 100 पतला किया गया है कि eluant के एक 90 माइक्रोलीटर नमूना चलाने के लिए जांच करने के लिए कि प्रोटीन eluted किया गया है और लक्ष्य प्रोटीन आकार के अनुरूप स्थिति में एक GFP संकेत की उपस्थिति को सत्यापित करने के लिए।
एक से 20 मोलर अनुपात में थ्रोम्बिन जोड़ें और eluted नमूने में EDTA के 10 मिलीमोलर जोड़ें। तीन घंटे तक चार डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेट। इसके बाद, एलुंट को 15 मिलीलीटर सेंट्रलिफ्यूगल फिल्टर ट्यूब में स्थानांतरित करें।
ट्यूब को 2, 800 बार गुरुत्वाकर्षण पर और पांच मिनट की वेतन वृद्धि में चार डिग्री सेल्सियस पर स्पिन करें ताकि एलेंट को 500 माइक्रोलीटर या उससे कम पर केंद्रित किया जा सके। प्रोटीन को फिर से खर्च करने और ध्यान केंद्रित करने से रोकने के लिए स्पिन के बीच प्रोटीन समाधान को ऊपर और नीचे पिपेट करें। बफर में एसएससी कॉलम पर ध्यान केंद्रित करें।
फास्ट प्रोटीन लिक्विड क्रोमेटोग्राफी चलाएं और 300 माइक्रोलीटर अंश इकट्ठा करें। फिर, ऊपरी अंशों को मिलाएं जिसमें टीआरपीसी 3 टेट्रामर होता है जैसा कि यूवी अवशोषण संकेत द्वारा कल्पना की गई है। और कम से कम पांच मिलीग्राम प्रति मिलीलीटर की अंतिम एकाग्रता के लिए फिर से ध्यान केंद्रित करें।
मानव TRPC3 0.01 से 20 माइक्रोमॉलर्स की एक महत्वपूर्ण मिसेल एकाग्रता के साथ डिटर्जेंट की एक किस्म में पूरी सेल घुलनशील है, और एक डीडीएम में चलाया गया था/ हालांकि डीडीएम/सीएसएस मानव TRPC3 की उच्चतम घुलनशीलता से पता चलता है, चोटी की स्थिति भी टेट्रामेरिक मानव TRPC3 होने के लिए बड़ी प्रतीत होता है । पूरी कोशिकाओं के घुलनशीलीकरण के बाद सेल लाइसिस मलबे को हटा दिया जाता है और घुलनशील प्रोटीन को एसएससी कॉलम पर लोड किया जाता है और एचपीएलसी पर डीडीएम/सीएसएस डिटर्जेंट में बफर युक्त होता है, ताकि टीआरपी 4 नियंत्रण के सापेक्ष विभिन्न परिस्थितियों में मानव TRPC3 की पूर्ण घुलनशीलता और पीक वॉल्यूम की तुलना की जा सके ।
विभिन्न डिटर्जेंट घुलनशील TRPC3 नमूनों के सभी ११.९ मिलीलीटर जो संभावना बहुत बड़ी है क्योंकि मानव TRPC3 के टेट्रामेरिक रूप सकारात्मक मानव नियंत्रण TRPM4 की तुलना में एक छोटे आणविक वजन है चारों ओर पीक पदों को दिखाने के लिए । इसके बाद डीडीएम/सीएसएस और डिजिऑनिन युक्त दो अलग-अलग घुलनशीलता और रनिंग बफर का परीक्षण किया जाता है । डिजिऑनिन युक्त बफर में प्रोटीन सकारात्मक नियंत्रण के सापेक्ष उचित स्थिति में उच्चतम चोटी की पैदावार करता है।
जबकि कोशिकाओं के 25 मिलीलीटर का उपयोग करके एक छोटे पैमाने पर शुद्धिकरण कई व्यापक चोटियों को दर्शाता है, प्रोटीन नकारात्मक दाग द्वारा 2D वर्गीकरण में एक एकल टेट्रामेलिक मानव TRPC3 चैनल की विशेषताओं को दर्शाता है। इसके बाद एडिटिव्स की जांच ह्यूमन TRPC3 के फिजिकल कैरेक्टर के आधार पर की जाती है । EDTA एक बरकरार टेट्रामेरिक पीक स्थिति में मानव TRPC3 को स्थिर करने पर एक उल्लेखनीय प्रभाव दिखाता है और क्रायो-ईएम माइक्रोग्राफ में कणों की संख्या में काफी वृद्धि हुई है और पृष्ठभूमि में शोर में कमी आई है।
अंतिम परिणामों की गुणवत्ता एचपीएलसी पर एफएससीसी प्रोफाइल की अच्छी समस्या निवारण पर निर्भर करती है। और शुद्धि के सभी चरणों को जल्दी से पूरा करने पर, आदर्श रूप से एक ही दिन में। इस प्रक्रिया के बाद संरचनात्मक निर्धारण, एंटीबॉडी उत्पादन और कार्यात्मक अध्ययन जैसे, बाध्यकारी परख या इलेक्ट्रोफिजियोलॉजी किया जा सकता है।
इस तकनीक को अन्य आयन चैनलों और प्रोटीन परिवारों का अध्ययन करने और संरचनात्मक निर्धारण से परे अनुप्रयोगों के लिए शुद्ध प्रोटीन का उत्पादन करने के लिए अनुकूलित किया जा सकता है । सेल कल्चर बायोहैजार्ड्स जैसे लैमिनार फ्लो हुड में काम करने, सुरक्षात्मक कपड़े पहनने और कचरे का ठीक से निपटान करने के लिए उचित सावधानियां बरती जानी चाहिए ।
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जैव रसायन अंक १४३ आयन चैनल झिल्ली प्रोटीन प्रोटीन शुद्धि संरचना निर्धारण क्रायो-इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी क्रायो-EM baculovirusRelated Videos
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